鼠衣原體肺部二次感染中NK細胞對免疫應答的調節(jié)作用.pdf

1、衣原體（Chlamydia）是一種嚴格胞內寄生的原核細胞型微生物，其中沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）感染可引起機體多種感染性疾病，如:生殖道感染引起的輸卵管炎、不育癥，呼吸道感染引起的肺炎、支氣管炎，以及眼部粘膜感染引起的沙眼。沙眼農(nóng)原體感染是一個長期慢性的過程，機體產(chǎn)生的細胞免疫反應強度如果不足以徹底清除細胞內寄生的衣原體，易形成持續(xù)性感染與組織病理損傷。在機體應對沙眼衣原體感染時，CD4+T細胞起主導性保護

2、作用，產(chǎn)生的多種Th1類細胞因子，如:IFN-γ、IL-2、TNF-α，在沙眼衣原體生殖道和肺部感染中均發(fā)揮重要的抗感染作用。其中IFN-γ除可直接抑制衣原體復制外，還對適應性免疫細胞起重要調節(jié)作用。B細胞以及衣原體特異性抗體也具有一定的保護性作用，并與CD4+T細胞有協(xié)同作用，而CD8+T細胞在抗沙眼衣原體感染中的作用比較微弱。
　　自然殺傷（natural killer，NK）細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的重要成員，在抵抗病原體感染

3、中發(fā)揮重要作用。NK細胞的活化是其表面的活化和抑制性受體相互作用，共同介導完成的。NK細胞抗感染免疫功能的發(fā)揮主要依靠兩條途徑實現(xiàn):1.通過識別被感染細胞，直接殺傷靶細胞;2.通過IFN-γ、IL-2等細胞因子的分泌，以及與DC的相互作用，募集和調節(jié)適應性免疫細胞的應答，抑制病原體的擴增。NK細胞殺傷能力和細胞因子分泌能力的激活依賴于其所處的細胞因子微環(huán)境，以及與免疫系統(tǒng)其他細胞的相互作用。傳統(tǒng)意義上，NK細胞主要在初次感染的早期應答中

4、發(fā)揮作用。最近有報道證實，NK細胞在病原體二次感染（如:結核桿菌、呼吸道合胞病毒）引起的機體免疫應答中也發(fā)揮重要作用。
　　我們前期工作發(fā)現(xiàn)，衣原體感染可以激活NK細胞;在小鼠衣原體肺部初次感染中，NK細胞可通過調節(jié)CD4+T細胞亞群的分化，進而發(fā)揮抗感染的免疫保護作用。小鼠體內NK細胞清除后，衣原體肺部感染加重，免疫保護性的Th1和Th17類細胞數(shù)量減少，免疫抑制性的Treg細胞數(shù)量增多。
　　本文在以上工作基礎上，進一步

5、探討了NK細胞在衣原體肺部二次感染中發(fā)揮的作用及其免疫機制。
　　一、小鼠肺部衣原體二次感染模型建立和二次感染小鼠體內T細胞應答特點
　　目的:探討與一次感染相比，衣原體肺部二次感染后，主要CD4+T細胞亞群的應答特點。方法:C57BL/6小鼠滴鼻吸入含鼠肺炎衣原體（Chlamydiamuridarum）的感染液，建立小鼠肺部一次感染;一次感染后6-8周（感染已完全恢復），小鼠再次滴鼻感染建立小鼠肺部二次感染模型。采用同齡小

6、鼠初次滴鼻感染，作為一次感染組。記錄體重繪制體重變化曲線;間接計數(shù)法檢測小鼠肺部包涵體形成單位(IFUs)數(shù)量;流式細胞術檢測兩組小鼠體內主要CD4+T細胞亞群Th1、Treg細胞數(shù)量。結果:與一次感染組相比，二次感染組小鼠的體重降低趨勢明顯減輕，肺部IFUs明顯降低，疾病恢復進程加快;細胞內細胞因子染色結果顯示，感染后6天，二次感染組小鼠的脾、縱膈淋巴結和肺組織中IFN-γ+CD4+T細胞（即Th1細胞）均顯著增多。Foxp3+CD2

7、5+CD4+T細胞（即Treg細胞）在一次感染和二次感染后均有擴增，但兩組間沒有明顯數(shù)量差異。結論:成功建立小鼠二次肺部感染模型;在衣原體二次感染中，Th1細胞迅速激活并擴增，是疾病迅速恢復的主要免疫機制。
　　二、NK細胞在小鼠肺部衣原體二次感染中的作用及機制
　　目的:探討NK細胞在衣原體肺部二次感染中的作用及機制。方法:采用小鼠肺部衣原體二次感染模型，實驗組小鼠在二次感染的-2、-1、1、3、5天分別尾靜脈注射anti

8、-asialo GM1 NK細胞中和抗體以清除體內NK細胞，二次感染對照組小鼠在同時間點注射同型抗體。體重記錄繪制體重變化曲線;間接計數(shù)法檢測小鼠肺部IFUs; ELISA技術檢測脾、縱膈淋巴結、肺中單個核細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ分泌量;流式細胞術檢測兩組小鼠體內（脾、縱膈淋巴結、肺）Th1、Treg細胞數(shù)量。結果:注射anti-asialoGM1抗體使小鼠體內NK細胞得到有效清除，二次感染后4天肺中NK細胞封閉效果可達到90.5％。二

9、次感染后，與同型對照組相比，NK細胞清除組小鼠肺部IFUs數(shù)量均增多，且感染后3天差異更加顯著。二次感染后NK細胞清除并沒有對小鼠體重下降造成明顯影響。感染后6天，與對照組相比，NK細胞清除組小鼠脾、縱膈淋巴結及肺中單個核細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ分泌量均顯著減少;NK細胞清除組小鼠的脾、淋巴結及肺中Th1細胞亞群在CD4+T細胞中所占比例均有所減少，但Treg細胞亞群比例有所增高。在衣原體二次感染中，NK細胞的清除對體內衣原體特異性Ig

10、G、IgG2a、IgG1的產(chǎn)生無明顯影響。說明NK細胞清除使二次感染小鼠肺部的衣原體載菌量增加，并在一定程度上削弱了機體Th1細胞應答，增強了Treg細胞應答。結論:在衣原體肺部二次感染中，NK細胞仍發(fā)揮一定的免疫保護作用，其機制可能與其通過免疫調節(jié)作用促進Th1細胞增殖，抑制Treg細胞應答有關。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn):1）衣原體肺部二次感染后，小鼠體內Th1細胞亞群顯著擴增，但Treg細胞亞群沒有明顯變化。提示Th1細胞免

11、疫應答的增強是二次感染疾病恢復進程加快的主要原因。2）二次感染后NK細胞清除組小鼠肺部衣原體載菌量增多，但小鼠體重變化差異不具有統(tǒng)計學意義。3）二次感染后NK細胞清除組小鼠體內（脾、淋巴結、肺）分泌IFN-γ水平下降、Th1細胞的比例減少、Treg細胞的比例增高。證明在衣原體肺部二次感染中，NK細胞發(fā)揮一定的抗感染保護作用，其可通過促進Th1細胞增殖、抑制Treg細胞應答，加強機體對衣原體的清除。該研究加深了對衣原體感染免疫機制的認識，