Toll樣受體4在小鼠肺部衣原體感染過程中作用的研究.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，C.trachomatis)所引起的疾病是當(dāng)前全世界嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一，但是其感染的免疫機(jī)制仍然沒有闡明。Toll樣受體4作為被人類首個(gè)發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的Toll樣蛋白，是Toll樣受體家族最重要的蛋白之一，人們對(duì)TLR4的研究大多是關(guān)注其在先天免疫方面所發(fā)揮的作用。但是在衣原體感染過程中Toll樣受體4所發(fā)揮的作用卻尚不清楚。本研究擬在建立沙眼衣原體肺部呼吸道感染模型的基礎(chǔ)上，

2、對(duì)沙眼衣原體在C3H/HeN小鼠，C3H/HeJ小鼠(TLR4基因位點(diǎn)突變)肺感染過程中肺部衣原體載量，肺部炎癥反應(yīng)，體重變化，存活率等各個(gè)方面進(jìn)行研究，以及免疫機(jī)制的初步探討，結(jié)果如下:
　　1.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠巨噬細(xì)胞體外刺激實(shí)驗(yàn)研究。顯示C3H/HeN小鼠巨噬細(xì)胞由于Toll樣受體4通路完整產(chǎn)生了更多的促炎癥細(xì)胞因子IL-6。
　　2.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后體重變化的研

3、究。取6-8周齡的C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠，滴鼻感染5×103IFU的沙眼衣原體鼠肺炎菌株(Chlamydiamuridarum，Cm)。監(jiān)測(cè)兩種不同小鼠在感染后不同天數(shù)的體重變化，發(fā)現(xiàn)C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體后體重下降幅度明顯大于正常小鼠，并且只有極少數(shù)C3H/HeJ小鼠能恢復(fù)至正常體重。
　　3.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后存活率研究。發(fā)現(xiàn)C3H/HeN小鼠在感染相同量衣原體之后存

4、活率顯著高于基因突變小鼠，并且大部分C3H/HeN小鼠能在感染后第10天開始逐漸恢復(fù)健康。
　　4.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后肺部衣原體載量的研究。結(jié)果顯示C3H/HeJ小鼠含有更高載量的衣原體，并且正常小鼠衣原體在感染后第12天出現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　5.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后肺組織病理變化的研究。通過小鼠肺組織H&E染色顯示，兩種不同小鼠在感染衣原體之后相同時(shí)間，C

5、3H/HeJ小鼠出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的炎癥浸潤(rùn)。
　　6.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后肺組織中髓過氧化物酶(MPO)的研究。通過化學(xué)發(fā)光免疫分析法結(jié)果顯示，Toll樣受體4基因突變小鼠在感染沙眼衣原體之后的第3天和第7天肺組織中顯著的嗜中性粒細(xì)胞的滲透。
　　7.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Toll樣受體4基因突變小鼠在感染后第3天和第7天

6、肺泡灌洗液中都含有更高的中性粒細(xì)胞百分比，在感染后第7天尤其顯著。
　　8.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)動(dòng)態(tài)變化研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種不同小鼠在感染沙眼衣原體后Treg細(xì)胞所占百分比沒有顯著變化，但是C3H/HeJ小鼠Treg細(xì)胞的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)卻在第3天顯著下降。
　　9.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠Th-1免疫反應(yīng)的研究。結(jié)果兩種小鼠IF

7、N-γ蛋白水平在感染之后各天也沒有顯著差異，說明兩種不同小鼠在感染沙眼衣原體后Th-1免疫反應(yīng)并沒有起關(guān)鍵作用。
　　10.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠Th-2免疫反應(yīng)的研究。結(jié)果顯示兩種小鼠感染沙眼衣原體之后Th-2免疫反應(yīng)并沒有差異。
　　11.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠IL-17/Th-17免疫反應(yīng)的研究。通過RT-PCR的方法檢測(cè)兩種小鼠肺組織中IL-6mRNA，IL-17mRNA水平的表達(dá)，通過流式細(xì)

8、胞儀檢測(cè)脾臟CD4+CD44+IL-17+在淋巴細(xì)胞所占比重，以及CD4+CD44+IL-17+的平均熒光強(qiáng)度(MFI)，最后進(jìn)一步通過ELISA方法檢測(cè)IL-17在兩種不同小鼠蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Toll樣受體4基因突變小鼠IL-6mRNA，IL-17mRNA水平，CD4+CD44+IL-17+在淋巴細(xì)胞所占比重以及CD4+CD44+IL-17+的平均熒光強(qiáng)度都低于正常小鼠，并且蛋白水平同樣低于正常小鼠。說明了IL-1

9、7/Th-17的免疫反應(yīng)需要TLR4信號(hào)通路。
　　12.C3H/HeN，C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原體之后Th-17相關(guān)趨化因子表達(dá)研究。通過RT-PCR的方法檢測(cè)兩種小鼠肺組織中KC，MIP-2mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，C3H/HeN小鼠KC的mRNA的表達(dá)水平在感染之后第3天顯著高于C3H/HeJ小鼠，并且C3H/HeN小鼠的MIP-2mRNA的表達(dá)水平在感染之后第7天也高于C3H/HeJ小鼠，說明IL-17下游的的

10、炎癥相關(guān)趨化因子的表達(dá)趨勢(shì)與IL-17/Th-17免疫反應(yīng)趨勢(shì)基本吻合。
　　綜上所述:C3H/HeN小鼠和C3H/HeJ小鼠在肺部感染沙眼衣原體之后，Toll樣受體4基因突變小鼠體重下降顯著，存活率低，并且肺組織中衣原體載量顯著高于正常小鼠，肺部出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，大量中性粒細(xì)胞滲透肺組織和肺泡中，并且盡管CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在所占百分比未變化的前提下，絕對(duì)細(xì)胞數(shù)發(fā)生了顯著的降低，同時(shí)Toll樣受體4基因突