豬鏈球菌2型感染相關(guān)因子篩選、鑒定及分子特性分析.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種革蘭氏陽性菌,有35個(gè)血清型(1～34,1/2),其中豬鏈球菌2型(SS2)可引起豬的急性敗血癥及相關(guān)人員感染而急性死亡。2005年7月在四川再次暴發(fā),倍受世界關(guān)注。目前,對SS2毒力因子的研究仍是零散研究,且處于體外研究階段,主集中于CPS、MRP、EF、SLY、GDH、GAPDH和FBPs等毒力因子的檢測及其重組表達(dá)蛋白體外功能等,尚不足以揭示SS2感染宿主時(shí)的真實(shí)情況。本試驗(yàn)運(yùn)

2、用IVIAT(in vivo induced antigen technology)通量篩選及鑒定SS2感染相關(guān)因子,并對部分基因的特性進(jìn)行了較為深入的探索,為全面認(rèn)識SS2感染相關(guān)因子在SS2感染過程中的作用鋪墊基礎(chǔ)。 1 SS2基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)Sanger研究所提供的SS2基因組序列,DNASTAR軟件模擬酶切,依酶切產(chǎn)物大小的分布情況,確定合適的限制性內(nèi)切酶。提取SS2四川流行株基因組DNA,用限制

3、性內(nèi)切酶部分酶切,調(diào)整酶切時(shí)間、溫度及酶量等條件,確定最適條件,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行大體積酶切,回收大小合適的片段。同時(shí)酶切表達(dá)載體系列(pET30abc),去磷酸化,回收線性化的載體。將基因組酶切片段按適當(dāng)?shù)谋壤謩e與載體連接,電轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5a,并用載體特異性引物分析片段插入率及其片段大小分布。然后分別提取質(zhì)粒,將其電轉(zhuǎn)化至高效表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中,構(gòu)建出三種基因組表達(dá)文庫。 2 SS2基因組表達(dá)文庫的免疫篩選、鑒定及功

4、能預(yù)測 制備并采集豬耐過SS2感染的康復(fù)血清,將得到的8份康復(fù)血清混合,分步與SS2體外表達(dá)的抗原(如全菌、菌裂物及胞外蛋白等)結(jié)合去除相應(yīng)的抗體,同時(shí)應(yīng)用間接ELISA監(jiān)測每一步的吸附效果。將經(jīng)上述步驟吸附過的血清對SS2基因組表達(dá)文庫進(jìn)行篩選,經(jīng)4輪篩選及4輪鑒定,共篩選出64個(gè)陽性克隆。將陽性克隆送公司測序,分析插入的序列,結(jié)果表明,其中60個(gè)克隆編碼48種蛋白,如代謝及能量代謝、分子合成、胞外蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、調(diào)控蛋白等及

5、功能未知蛋白。另參照歐洲株P(guān)1/7基因組序列,將上述序列進(jìn)行基因組定位分析,以了解這些感染相關(guān)因子在基因組的分布。 3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR比較SS2感染相關(guān)因子的體內(nèi)外表達(dá)差異 根據(jù)已公布的SS2歐洲株P(guān)1/7株或加拿大株89/1591株的序列,設(shè)計(jì)13對感染相關(guān)因子(trag,ysirk,abc56,sdh,srt,abc15,orf1616,nlpa,hp10,ptss,cwh,flps)的檢測引物,同時(shí)以SS

6、2四川分離株ZY05719的gapdh為內(nèi)參,參照其序列設(shè)計(jì)引物。體外培養(yǎng),分別于OD600值為0.1,0.2,0.4,0.6和0.8時(shí)收集菌體,提取菌體總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,熒光定量PCR分析SS2體外培養(yǎng)時(shí)mRNA表達(dá)水平。體內(nèi)感染,以微型SPF香豬為動(dòng)物模型,分別采用靜脈和肌肉注射的方式感染ZY05719,感染后于不同時(shí)間段采血,從菌血中分離SS2,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,熒光定量PCR分析SS2體內(nèi)感染培養(yǎng)時(shí)mRNA表

7、達(dá)水平。在分別分析體外培養(yǎng)和體內(nèi)感染的基礎(chǔ)上,比較體內(nèi)增殖時(shí)mRNA表達(dá)差異。結(jié)果表明,體外培養(yǎng)時(shí)這些感染相關(guān)因子在對數(shù)生長期時(shí)可瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄,但隨即mRNA開始降解,這13個(gè)基因的mRNA水平均迅速下降；體內(nèi)感染時(shí),靜脈注射途徑:orf1616,trag,nlpa,abc56和flps呈持續(xù)上升趨勢,abc15,srt,ysirk,hp10和ptss呈先上升后下降,cwh,hprk和sdh呈下降。肌肉注射途徑:orf1616,trag,h

8、prk,sdh及/flps呈上升趨勢,abc15,nlpa,srt,ysirk,abc56,cwh,hp10和ptss呈下降趨勢。體內(nèi)外增殖時(shí)感染因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較結(jié)果表明,各感染相關(guān)因子在SS2體內(nèi)感染時(shí),不同感染途徑及不同時(shí)間段mRNA轉(zhuǎn)錄水平不盡一致,其表達(dá)水平相對于體外培養(yǎng)時(shí)均有不同程度的上調(diào)。 4 新鑒定的SS2感染相關(guān)因子的分布分析 參考已公布的SS2歐洲株P(guān)1/7株或加拿大株89/1591株的序列,設(shè)

9、計(jì)13對感染相關(guān)因子(trag,ysirk,abc56,sdh,srt,abc15,orf1616,hprk,hp10,ptss,cwh,flps)的檢測引物,取SS2我國江蘇和四川流行株、其它臨床分離株和參考株,及豬鏈球菌1型、1/2型、7型、9型及C群,共39株,分別以其DNA為模板,PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,在SS2菌株中,除SS2-N和無毒株T15全部陰性,其它不同地區(qū)不同年份的均有不同程度的分布,2005年四川分離株(含兩人源株)

10、全部呈陽性,1998年江蘇分離株HA9801除abc15陰性外,其它因子均陽性,但1998年人源株98012全部陽性。其它豬鏈球菌,C群鏈球菌均陰性,SS1、SS1/2、SS7和SS9各有其自身分布特點(diǎn),不盡一致。 5 SS2新的感染相關(guān)因子自溶素的鑒定與分析 根據(jù)Sanger研究所公布的SS2型P1/7株的自溶素的基因序列,分2段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物以擴(kuò)出完整orf序列,取SS2我國江蘇和四川流行株(HA9801和ZY0571

11、9)、人源株(260)、參考株(ATCC43765)和歐洲株(11611),分別以其DNA為模板,PCR擴(kuò)增,裝入T載體測序,分別拼接得出各自完整序列。結(jié)果表明,我國流行株的自溶素orf基因全長為3108bp,軟件分析結(jié)果顯示,該蛋白含有6個(gè)重復(fù)的"GBS_Bsp-like"域和1個(gè)"N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶”域,與SS2歐洲株有較高同源性(99.8％),但與SS2加拿大株差異較大。另參照已知的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶三

12、級結(jié)構(gòu)對我國兩次流行株等的自溶素進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果表明,在該域內(nèi),我國株的自溶素與加拿大的在局部結(jié)構(gòu)域上存在差異,與歐洲株的差異較小。在DNASTAR分析所編碼蛋白的抗原性的基礎(chǔ)上,另設(shè)計(jì)引物,以四川ZY05719株DNA為模板,PCR擴(kuò)增具有良好免疫原性的片段基因,并定向克隆至表達(dá)載體pET30a(+)中,進(jìn)行重組表達(dá),SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá),用康復(fù)血清做Western blot,結(jié)果表明,所獲得重組自溶素與康復(fù)血清有

13、著良好反應(yīng)性。 6 豬鏈球菌調(diào)控蛋白HprK的鑒定與分子生物學(xué)特性分析 根據(jù)Sanger研究所公布的SS2 P1/7株的hprk的基因序列,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增完整orf序列,取SS2我國兩次流行株(HA9801和ZY05719)、人源株(260)、參考株(ATCC43765)和歐洲株(11611),分別以其DNA為模板,PCR擴(kuò)增,裝入T載體測序,分別拼接得出各自完整序列。結(jié)果表明,我國兩次流行株等的hprk基因全長均為933

14、bp,編碼蛋白由310氨基酸組成。比對結(jié)果表明,hprk高度保守,各地分離株之間同源性高達(dá)98％以上,且與其它細(xì)菌的hprk有著較高同源性。另參照已知的HprK三級結(jié)構(gòu)對兩次疫情代表株等的HprK進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果表明,我國株的HprK與參考蛋白的空間結(jié)構(gòu)非常接近,與歐洲株的差異較小,但加拿大株缺一個(gè)β-片層。進(jìn)化關(guān)系分析表明,HprK與其它細(xì)菌的HprK有較高的親緣關(guān)系,與鏈球菌屬親緣最近,各豬鏈球菌HprK之間雖有差異,但仍在同

15、一個(gè)進(jìn)化分支上。另信號肽分析表明,該蛋白不含信號肽。 7 豬鏈球菌一種新的功能未知的表面蛋白的鑒定與分析 根據(jù)Sanger研究所公布的SS2 P1/7株的第1616編碼蛋白的基因序列,分三段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物以擴(kuò)出完整orf序列,取SS2我國兩次流行株(HA9801和ZY05719)、人源株(260)、參考株(ATCC43765)和歐洲株(11611),分別以其DNA為模板,PCR擴(kuò)增,裝入T載體測序,分別拼接得出各自完整序列

16、。結(jié)果表明,包括我國兩次流行株在內(nèi)的上述5株的ORF1616均由1121個(gè)氨基酸組成,GenBank比對分析表明,上述5株的ORF1616與加拿大株89/1591差異較大,后者的僅由917個(gè)氨基酸組成。 Sanger數(shù)據(jù)庫比對分析表明,這5株的與P1/7株的有較高的同源性,同源性均在99％以上。進(jìn)化關(guān)系分析表明,ORF1616與豬鏈球菌功能推測蛋白親緣關(guān)系較近,但與無乳鏈球菌的關(guān)系較遠(yuǎn)。另信號肽分析表明,該蛋白存在37個(gè)氨基酸的

17、信號肽,切割位置在Ala和Asp之間。 8 SS2三種感染相關(guān)因子突變質(zhì)粒的構(gòu)建 為進(jìn)一步研究感染相關(guān)因子(cwh,hprk和orf1616)在SS2感染過程中作用。本試驗(yàn)構(gòu)建SS2三種感染相關(guān)因子的突變質(zhì)粒。參考前期四川流行株ZY05719三個(gè)基因全序列結(jié)果及歐洲株P(guān)1/7的序列,在各基因5’端及其上游區(qū)和3’端及其下游區(qū)分別設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增各基因的上、下游片段,經(jīng)酶切后插入T載體,經(jīng)鑒定及測序確認(rèn)后,分別將這些片