豬鏈球菌2型：5型弱毒株交叉保護性與類Ⅳ型分泌系統(tǒng)在致病中的作用機制.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）是重要的人獸共患病原菌，在世界范圍內(nèi)均有分布。該菌可通過呼吸道及黏膜途徑感染人畜引起敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎等臨床病癥。豬鏈球菌病是養(yǎng)豬業(yè)中嚴重的細菌性傳染病之一，由病死豬傳染給人可導致公共衛(wèi)生事件。中國于1998年與2005年先后兩次暴發(fā)人感染豬鏈球菌2型（S.suis2）的群體事件，累計引起52人死亡，其中鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal tox

2、ic shock syndrome，STSS)患者死亡最多(占96.2％)。這些患者病程通常只有1-2d，臨床主要表現(xiàn)為急性高熱、低血壓、彌散性血管內(nèi)凝集與多臟器功能衰竭，不同于以往的緩和性的豬鏈球菌感染。研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)暴發(fā)的這兩次豬鏈球菌2型分離株為強毒ST7型菌株，含有獨特的89K致病島。疫苗是預(yù)防多種豬病的重要措施之一，但豬鏈球菌疫苗開發(fā)研究緩慢，現(xiàn)有的豬鏈球菌疫苗存在接種劑量大、免疫效果不穩(wěn)定與對其它非2型感染性豬鏈球菌強毒株交叉

3、保護性差等缺陷。
　　本課題旨在:(1)篩選獲得可對流行率較高的S.suis2與S.suis9兩種血清型強毒株提供較好交叉免疫保護的弱毒活疫苗候選菌株;(2)闡明豬鏈球菌2型類Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)virD4基因在SS2致病中的作用;(3)VirD4介導的肽酰脯氨酰折疊酶PrsA誘導細胞死亡的機制。
　　1.豬鏈球菌5型XS045活疫苗候選株對2型與9型強毒株感染提供交叉保護
　　通過黏附感染與血清學分析獲得1株高黏

4、附力5型XS045候選株（黏附率達26.7％），致病性與毒力基因篩查結(jié)果顯示該菌株對上皮細胞毒性小，對小鼠、斑馬魚與仔豬致病性均較低，菌株先天缺失Suilysin、MRP與DltA等毒力因子，含有已報道的S.suis大部分免疫原性蛋白。XS045活菌在小鼠體內(nèi)定植能力較強，可在血液與臟器中持續(xù)存在兩周以上，安全性較好。小鼠模型免疫保護試驗結(jié)果顯示XS045活菌免疫原性較好，可誘導機體產(chǎn)生高滴度的抗體（加強免疫后血清效價達1∶25600）

5、，免疫小鼠可抵抗致死劑量的S.suis2型（HA9801）與S.suis9型(JX13)強毒菌株的感染，保護率分別為100％與85％。黏附拮抗、全血殺傷、吞噬調(diào)理與抗體結(jié)合能力檢測發(fā)現(xiàn)XS045活菌免疫對HA9801與JX13菌株感染提供交叉保護的可能機制是該菌包含有這兩株強毒細菌共有表面抗原，XS045高免血清與S.suis2型與S.suis9型菌株表面蛋白反應(yīng)性較強，可有效結(jié)合S.suis2與S.suis9全菌;高免血清預(yù)處理的S.

6、suis2型與S.suis9型菌體對上皮細胞HEp-2黏附力下降，更易于被吞噬細胞或全血吞噬與清除。這說明XS045免疫后有效誘導機體產(chǎn)生交叉調(diào)理作用的抗體是抵抗S.suis2型與S.suis9型強毒株感染的可能原因之一。
　　2.豬鏈球菌2型類Ⅳ型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵因子VirD4氧化應(yīng)激后可誘導PrsA等蛋白差異分泌
　　同源重組法構(gòu)建豬鏈球菌2型HA9801的T4SS同源蛋白VirD4與VirB4基因缺失株，VirD4參與細菌

7、毒力，具有抗吞噬作用，VirD4突變株更容易被不同來源的吞噬細胞所吞噬，其中以骨髓源巨噬細胞(BMDM)最明顯，吞噬量是親本株的3倍。體內(nèi)體外感染試驗證實VirD4參與S.suis2型菌株的早期致炎反應(yīng)，缺失突變株感染致宿主炎癥因子分泌顯著下調(diào)。過氧化氫體外刺激與RAW264.7細胞模型證實氧化應(yīng)激可分別使VirD4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)55.3與9.8倍;對過氧化氫應(yīng)激后親本菌株與VirD4突變株的培養(yǎng)上清分別進行蛋白質(zhì)雙向電泳與差異蛋白質(zhì)譜鑒

8、定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)親本株與VirD4突變株分別有33個與148個差異在1.5倍以上的分泌蛋白;其中親本株豐度較高且上調(diào)差異在3倍以上的分泌蛋白有3個，包括肽酰脯氨酰折疊酶PrsA(Parvulin-like peptidyl-prolyl isomerase);VirD4突變株中明顯上調(diào)的則有7個。這些蛋白大多為多功能蛋白，可能在DNA損傷修復、核酸代謝、糖代謝、應(yīng)激調(diào)控與細菌致病性中扮演重要作用，差異蛋白在轉(zhuǎn)錄水平得到驗證，這為進一步分析T

9、4SS效應(yīng)因子的功能提供了基礎(chǔ)。
　　3.PrsA可誘導細胞死亡并刺激細胞釋放炎癥因子
　　體外原核表達與純化豬鏈球菌2型T4SS相關(guān)差異分泌蛋白PrsA，體外刺激小鼠bEND3.0與RAW264.7細胞后發(fā)現(xiàn)PrsA因子具有劑量（10-100μg/ml）與時間依賴的細胞毒性與致炎效應(yīng)，且致細胞死亡作用與細菌溶血素樣因子的穿孔機制無關(guān);經(jīng)自噬、凋亡、焦亡與壞死等細胞死亡方式鑒定發(fā)現(xiàn)PrsA主要引起細胞焦亡，并伴隨壞死性凋亡，

10、細胞焦亡相關(guān)抑制劑Ac-YVAD-cmk(100μM)可以明顯緩解該蛋白引起的細胞死亡。體外截短表達PrsA不同區(qū)域蛋白:PrsA折疊酶功能域PPIase、包含PPIase的N端結(jié)構(gòu)域截短蛋白片段(NP)以及包含PPIase的C端結(jié)構(gòu)域截短蛋白片段(PC)，分別刺激小鼠bEND3.0與RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn)N端與C端結(jié)構(gòu)域為PrsA誘導細胞死亡所必需，折疊酶酶學催化結(jié)構(gòu)域PPIase并不主導PrsA的細胞毒性與致炎效應(yīng);通過RNA干擾

11、tlr2和myd88，發(fā)現(xiàn)TLR2不是PrsA的模式識別受體，TLR2-MyD88途徑不參與PrsA誘導的細胞死亡。上述研究為豬鏈球菌PrsA在豬鏈球菌致病中的機理奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述:本研究首次報道獲得了可對強毒豬鏈球菌2型與9型菌株提供交叉保護力的XS045活疫苗候選株;證明豬鏈球菌2型類Ⅳ型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白VirD4介導細菌的致病性，氧化應(yīng)激可顯著上調(diào)其表達，可能參與PrsA等因子的分泌;PrsA可以誘導炎癥因子釋放，