豬鏈球菌2型基因島的結(jié)構(gòu)和功能分析.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，Ssuis)是一種重要的人獸共患病病原菌，可感染豬等多種動(dòng)物和人，具有很強(qiáng)致病性。根據(jù)其莢膜多糖抗原特性的差異可分為35個(gè)血清型（1～34型及1/2型），其中血清2型呈全球性分布，為最常見致病血清型。豬鏈球菌2型(SS2)感染引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和敗血癥等，是影響全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染性疾病之一。另外SS2也可感染與養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)密切接觸的人群，引起人的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、耳聾、運(yùn)動(dòng)功

2、能紊亂等癥狀，甚至急性死亡。1998年和2005年，分別在中國(guó)江蘇省和四川省兩次由豬感染人，表現(xiàn)為鏈球菌中毒性休克（streptococcal toxic shock syndrome，STSS）的暴發(fā)流行，引起國(guó)內(nèi)外對(duì)SS2感染導(dǎo)致公共健康問題的廣泛關(guān)注。此外，SS2感染在歐洲、北美和東南亞等地區(qū)也多有散發(fā)病例。
　　 目前已有多株SS2致病株完成了全基因組序列測(cè)定，并且鑒定和分析了一些可能與致病性相關(guān)的基因和蛋白,但是SS2

3、如何生存、繁殖并感染宿主的機(jī)制還不清楚，對(duì)該病原菌致病性并沒有一個(gè)系統(tǒng)和全面的了解。因?yàn)镾S2不同菌株致病性存在差異，通過(guò)基因組的比較分析，在差異基因組水平上確定和注釋細(xì)菌和宿主相互作用相關(guān)的特異基因，有可能幫助我們了解細(xì)菌的感染過(guò)程和致病機(jī)理。其中，由基因水平轉(zhuǎn)移獲得的致病性基因島(pathogenicity islands，PAIs)在多種病原菌中已證明與致病性密切相關(guān)，已有的研究包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和肺

4、炎鏈球菌等。我們?cè)O(shè)想，在SS2中可能也存在著類似的基因島，這些基因島與細(xì)菌的致病性、適應(yīng)性以及代謝能力等相關(guān)。而與細(xì)菌毒力相關(guān)的致病島存在于SS2的毒力菌株中，在其無(wú)毒菌株或弱毒菌株中缺失或部分缺失。
　　 本研究以SS2中國(guó)致病株為基礎(chǔ)，參考國(guó)內(nèi)外SS2菌株基因組信息，對(duì)SS2可能的基因島詳細(xì)分析。通過(guò)Insilico的分析，在SS2己測(cè)序致病菌株SC84株基因組中推測(cè)13個(gè)可能的基因島，加之報(bào)道的89K基因島，共14個(gè)基因島

5、。這些假定的基因島均是全基因組中GC含量有顯著差異的區(qū)域，多數(shù)攜帶有轉(zhuǎn)座酶(transposase)或者整合酶(site-specific recombinase，phage integrase)等元件，并且旁側(cè)具有較典型的插入位點(diǎn)，顯示可能為外源基因水平轉(zhuǎn)移獲得。其中有些為已知的功能基因群，比如已知的編碼合成莢膜多糖(CPS)和菌體多糖（細(xì)胞壁組分，鼠李糖-葡萄糖樣多糖，RGP）的兩個(gè)基因群（GI3和GI6），以及srtC345菌毛基

6、因群(GI12)，其余為未知功能或未鑒定的基因島樣區(qū)域。
　　 通過(guò)分析這些基因島在SS2致病株和非致病株中的分布差異，以期研究基因島與SS2菌株致病性的關(guān)系。通過(guò)生物信息學(xué)的分析以及PCR和測(cè)序分析，最終認(rèn)定基因島GI4、GI8和GI12，為可能的致病性基因島，它們?cè)诓煌腟S2分離株中分布存在差異，存在于致病株而在一些非致病株中完整缺失。其中基因島GI4和GI8攜帶完整的噬茵體整合酶以及部分噬菌體相關(guān)蛋白，表明可能是通過(guò)溶原

7、型噬菌體整合入基因組。而其余的基因島包括GI1、GI2、GI3、GI5、GI6、GI7、GI9、GI10、GI11、GI13，在所分析的SS2致病株和非致病株中均存在，認(rèn)定這些基因島在SS2菌株中具有遺傳穩(wěn)定性和保守性，與細(xì)菌致病性無(wú)直接關(guān)聯(lián)。
　　 隨后對(duì)可能的致病性基因島GI12做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能分析，該基因島攜帶假定的srtC345菌毛基因群，包括3個(gè)分選酶基因和4個(gè)假定的菌毛亞單位蛋白基因，其遺傳組成和結(jié)構(gòu)與已知的肺炎

8、鏈球菌rlrA菌毛基因島非常相似。包括肺炎鏈球菌和白喉棒狀桿菌等多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的菌毛其基因組成和蛋白結(jié)構(gòu)都非常相近，菌毛是由同一個(gè)基因群編碼的多個(gè)單體菌毛亞單位蛋白共價(jià)連接形成的聚合體，由分選酶通過(guò)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)將各單體蛋白連接并最終錨定在細(xì)胞壁肽聚糖上。菌毛在細(xì)菌的黏附、細(xì)胞侵入、宿主免疫逃避等方面起關(guān)鍵作用，是重要的致病因子。本研究還對(duì)SS2不同分離株中菌毛基因群和分選酶基因分布進(jìn)行比較分析，在中國(guó)強(qiáng)致病株SC84和ZY458等菌株基

9、因組中共有3個(gè)假定的菌毛基因群，其中只有srtC345菌毛基因群（基因島GI12）在致病株和非致病株中分布存在差異，可能與致病性直接相關(guān)。
　　 通過(guò)體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究基因島GI12的功能，細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)證明，攜帶基因島GI12的SS2菌株細(xì)胞黏附能力顯著高于不含該基因島的菌株，而將基因島GI12全序列通過(guò)穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入SS2非致病株B22，其細(xì)胞黏附能力明顯提高。本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)基因敲除技術(shù)分析基因島GI12的功能，構(gòu)建自殺質(zhì)粒導(dǎo)入