糖基化對SK-N-SH細胞神經(jīng)絲的磷酸化及其功能的影響.pdf

1、目的：神經(jīng)絲蛋白是神經(jīng)細胞重要的骨架蛋白，由NF-L、NF-M和NF-H三個亞基組成，在維持細胞骨架、穩(wěn)定細胞形態(tài)和軸突轉(zhuǎn)運方面有十分重要作用。過度磷酸化的神經(jīng)絲是AD腦中NFT的一種主要成分和早期的病理改變，影響神經(jīng)細胞的軸突轉(zhuǎn)運功能。糖基化是蛋白質(zhì)的另一種重要的翻譯后修飾方式。與磷酸化的性質(zhì)相似，修飾同一蛋白質(zhì)的相同或鄰近絲氨酸或者蘇氨酸的羥基，可能存在相互調(diào)節(jié)。研究表明：AD腦神經(jīng)絲蛋白的糖基化修飾水平降低，伴隨著磷酸化修飾水平增

2、加，其機制目前尚不清楚。本實驗在細胞水平探討神經(jīng)絲蛋白糖基化修飾水平的改變能否調(diào)節(jié)磷酸化和軸突轉(zhuǎn)運的功能，闡明神經(jīng)絲蛋白的糖基化在AD發(fā)病機制中的作用，為AD的防治提供新的思路。方法：我們采用不同藥物通過不同機制干預(yù)SK-N-SH細胞的糖基化；采用MTT方法篩選合適的藥物濃度和對細胞活性的影響；采用蛋白免疫印跡和細胞免疫熒光化學(xué)方法觀察神經(jīng)絲蛋白糖基化和磷酸化的改變，用PI/Hoechst和DAPI染色觀察細胞的死亡方式；同時，我們采用

3、GFP-NFM轉(zhuǎn)染細胞，熒光標記神經(jīng)絲蛋白，熒光漂白恢復(fù)技術(shù)觀察糖基化的改變對神經(jīng)絲蛋白軸突轉(zhuǎn)運功能的影響。結(jié)果：與對照組相比，Alloxan處理細胞誘導(dǎo)細胞活性減低，神經(jīng)絲蛋白過度磷酸化且過度磷酸化的神經(jīng)絲在胞體異常聚集，而糖基化水平降低；用20μMNAG-Ae預(yù)處理12小時細胞不影響細胞的活性，提高細胞的糖基化水平，減少Alloxan誘導(dǎo)的細胞過度磷酸化和聚集；Alloxan誘導(dǎo)的細胞死亡包括程序性凋亡和繼發(fā)性壞死，而20μMNAG

4、-Ae預(yù)處理12小時可以保護Alloxan誘導(dǎo)的細胞凋亡和壞死；Alloxan處理細胞細胞熒光漂白后恢復(fù)速度減慢，而20μMNAG-Ae處理細胞細胞熒光漂白后恢復(fù)速度增快。DON處理細胞，細胞神經(jīng)絲蛋白糖基化水平降低，過度磷酸化且過度磷酸化的神經(jīng)絲蛋白在胞體異常聚集，熒光漂白后恢復(fù)速度減慢。結(jié)論：減低細胞的糖基化能夠誘導(dǎo)AD樣神經(jīng)細胞的過度磷酸化和細胞活性下降，影響神經(jīng)絲蛋白軸突轉(zhuǎn)運功能，而增加細胞糖基化能夠改善細胞磷酸化，有力地保護神