MANF對β-淀粉樣蛋白和糖氧剝奪-再灌注誘導的神經細胞凋亡性ER應激的抑制作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種原發(fā)于中樞神經系統(tǒng)的退行性疾病，起病隱匿，病程進展緩慢，是最常見的一種癡呆。目前臨床上尚無有效的治療措施，隨著本病的進展可能導致患者死亡。根據國際阿爾茨海默病協(xié)會2013年公布的最新統(tǒng)計結果，目前全球約有4400萬癡呆患者，到2050年患者人數有可能達到1.35億[1]。在美國，AD位于死亡原因的第6位，是65歲以上人群第5大死亡原因，并且患病人數仍逐年增加[2,3]。至

2、今AD的病因及發(fā)病機制尚未闡明，眾多研究發(fā)現淀粉樣前體蛋白（APP）、早老素1（PSN1）和早老素2（PSN2）的突變可能導致早發(fā)家族型AD。65歲之后發(fā)病的晚發(fā)型AD與載脂蛋白E密切相關[4]。AD特征的神經病理學改變?yōu)樯窠浽猞碌矸蹣拥鞍自谔囟X區(qū)聚集形成老年斑（Senile plaques，SP），Tau蛋白過度磷酸化形成神經原纖維纏結（Neurofibrillary tangles，NFTs）。海馬是哺乳動物自然發(fā)育過程中神經細

3、胞新生的主要區(qū)域之一，也是AD受累的主要腦區(qū)，近年來越來越多關于AD基礎研究及動物模型的研究多關注對海馬組織的影響。由于獲得正常人及AD患者腦組織標本相當困難，因此為了研究AD的發(fā)病機制、開發(fā)新的有效治療措施，目前多選用AD細胞模型及動物模型進行研究。攜帶APP和PS1雙突變基因的小鼠具有AD主要的神經病理學改變--老年斑的形成，并且具有記憶力減退的特點，是研究AD相對理想的動物模型。研究發(fā)現內質網（Endoplasmic Reticu

4、lum，ER）功能異常與AD的發(fā)病具有相關性，從基因水平到蛋白質翻譯后修飾，ER應激與AD相關的機制呈多樣化和復雜化[5]。在AD患者死后大腦標本、AD動物模型以及體外細胞試驗中均發(fā)現UPR激活的標志，表明ER應激和AD之間的有著重要的聯系[6]。
　　中腦星形膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）是一種ER應激特異性分泌蛋白，對

5、ER應激敏感，ER應激可誘導MANF的表達，在腦缺血、帕金森病、腦萎縮側索硬化等神經退行性疾病中具有神經保護作用[7-11]，但MANF神經保護的作用機制尚未得到清晰闡明。AD屬于神經退行性疾病，蛋白質聚集可誘發(fā)ER應激反應，本實驗室前期研究發(fā)現，MANF抑制Tau蛋白過度磷酸化誘導的神經細胞損傷[12]；并發(fā)現腦缺血能夠引起神經元細胞發(fā)生ER應激反應，同時誘導MANF表達增高。在體外實驗中證實MANF能促進神經元細胞增殖，抑制ER應激

6、誘導的細胞凋亡，而MANF在AD中的功能尚不明確，本研究發(fā)現在攜帶APP和PS1雙突變基因的癡呆小鼠海馬和大腦皮質神經元中MANF表達強陽性，通過體外實驗證實MANF具有抑制Aβ1-42誘導的神經毒性的作用。
　　目的
　　探討MANF在Aβ1-42誘導的神經細胞損傷中作用及作用途徑。
　　方法
　　用Aβ1-42處理體外培養(yǎng)的人源神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y細胞株，誘導神經毒性，將細胞分為四組：正常對照（n

7、ormal control，NC）組、無血清（serum-free）組、Aβ1-42組和TM組（陽性對照）。用MTT法檢測細胞增殖活性，用PI染色法檢測細胞死亡率，用細胞免疫熒光雙標法觀察MANF和GRP78/BiP的表達。用免疫組織化學法觀察MANF在攜帶APP/PS1雙突變基因的癡呆小鼠海馬及大腦皮質神經元中的表達。將MANF過表達質粒pcDNA3.1-MANF-FLAG和MANF-siRNA寡核苷酸序列轉染體外培養(yǎng)小鼠來源的神經母

8、細胞瘤細胞株N2a細胞，經Aβ1-42誘導神經毒性，用Westtern blot法檢測N2a細胞轉染MANF過表達質粒和干擾內源性MANF基因后內質網（ER）應激相關蛋白及促凋亡蛋白的表達。
　　結果
　　1．Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞損傷
　　體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，經不同濃度的Aβ1-42處理不同時間，MTT檢測結果顯示SH-SY5Y細胞增殖活性隨Aβ1-42濃度的增加而下降。之后用10μM的Aβ1-

9、42處理SH-SY5Y細胞不同時間，MTT檢測發(fā)現隨Aβ1-42處理時間增加，細胞增殖活性下降。對應的，PI染色結果顯示SH-SY5Y細胞死亡率隨Aβ1-42濃度的增加而逐漸增加。
　　2．Aβ1-42誘導神經細胞發(fā)生ER應激并誘導MANF表達上調
　　用10μM的Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞24 h，Western blot檢測發(fā)現ER應激標志性分子伴侶GRP78/BiP、促凋亡蛋白CHOP/GADD153和clea

10、ved caspase-3的表達增加，并且對ER應激敏感的MANF蛋白表達亦增多。
　　3. APP/PS1小鼠海馬及其大腦皮質神經元中MANF表達強陽性
　　4．MANF對Aβ1-42神經毒性的抑制作用
　　4.1 MANF過表達減弱Aβ1-42的神經毒性
　　體外培養(yǎng)小鼠來源的神經母細胞瘤細胞系N2a細胞系，采用陽離子脂質體Lipofactamine2000TM瞬時轉染的方法，轉染MANF過表達質粒pcDNA

11、3.1-
　　MANF-FLAG以及對照空載體pcDNA3.1，Western blot檢測轉染后給予10μM的Aβ1-42處理24 h，結果提示過表達MANF可抑制GRP78/BiP、CHOP/GADD153、cleaved caspase-3的表達。
　　4.2敲減內源性MANF基因增加Aβ1-42誘導的神經毒性
　　在N2a細胞中轉染敲減MANF的siRNA以及陰性對照，在轉染后給予10μM的Aβ1-42處理24

12、 h。Western blot檢測結果發(fā)現敲減內源性MANF基因可使GRP78/BiP、CHOP/GADD153、cleaved caspase-3的表達增加。
　　結論
　　MANF可通過抑制ER應激途經引起的細胞凋亡抑制Aβ1-42誘導的細胞損傷。
　　缺血性卒中是人類的主要死亡原因之一，本病發(fā)病率逐年升高，高致殘率及高致死率是本病的特點，尚無有效的治愈措施。腦缺血能夠誘發(fā)神經細胞內質網（ER）功能損傷，誘發(fā)ER應

13、激反應[37,38]。ER應激是啟動細胞凋亡的重要途徑之一，研究表明ER應激參與了腦缺血的病理生理過程，缺血缺氧可導致細胞膜通透性增加、線粒體及溶酶體損傷，再灌注時期由于氧自由基大量釋放、細胞內鈣超載、炎癥細胞浸潤等多種因素作用，可引起細胞代謝和功能障礙，發(fā)生形態(tài)和結構改變，甚至導致細胞死亡[39-41]。因此ER應激在鬧缺血性損傷中具有重要作用[40]。星形膠質細胞源性的神經營養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-d

14、erived neurotrophic
　　factor，MANF）是一種可分泌的小分子蛋白，在ER應激時特異的表達上調[11]。MANF的保護作用機制尚不十分明確。本研究旨在探索MANF是否通過抑制ER應激反應來保護OGD/R誘導的神經細胞損傷。結果表明MANF蛋白可顯著改善OGD/R誘導損傷的SH-SY5Y細胞狀態(tài)，提高細胞存活率，減少促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表達。本研究將為揭示MANF在缺血/

15、再灌注損傷中的保護機制，為MANF應用于臨床治療缺血性卒中提供實驗依據。
　　目的：
　　研究MANF對糖氧剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導的神經細胞損傷的保護作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人來源的神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，進行糖氧剝奪（OGD）6 h，再灌注（R）12 h。表達和純化重組人MANF蛋白。在再灌注時期，根據是否給

16、予重組人MANF蛋白處理（2?mol·L-1，12 h），將細胞分為正常對照組（NC）、NC+MANF組、OGD/R組和OGD/R+MANF組。隨后光學顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞形態(tài)的改變，MTT法檢測細胞存活率，PI染色法檢測細胞死亡率，免疫印跡法檢測內源性MANF蛋白、ER應激相關蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表達。用細胞免疫熒光染色法觀察GRP78

17、/BiP和CHOP的表達定位。
　　結果：
　　1．重組人MANF改善OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞增殖活性損傷
　　經過不同時間(0 h、3 h、6 h、8 h、12 h)OGD處理后，給予再灌注12 h處理，MTT檢測結果顯示：隨著OGD誘導時間的延長，細胞存活率逐漸降低，OGD6 h/R12 h時，細胞存活率下降接近50％，OGD大于8 h之后細胞存活率顯著下降，低至40%以下。OGD+MANF組細胞增殖活性

18、顯著高于OGD/R組。OGD6 h/R12 h處理后細胞體積變小，突觸變短或消失，MANF明顯改善該細胞的狀態(tài)。該結果表明重組人MANF蛋白對OGD/R誘導的細胞損傷有抑制作用。
　　2.重組人MANF抑制OGD/R誘導的細胞死亡
　　PI染色可見NC組及NC+MANF組僅有少量PI染色陽性細胞，而OGD/R組PI染色陽性細胞明顯多于NC組。OGD/R+MANF組較OGD/R組死亡細胞數顯著減少，死亡率下降。該結果表明重組人

19、MANF蛋白能抑制OGD/R誘導的細胞死亡。
　　3. OGD/R誘導的ER應激相關蛋白表達及MANF的作用
　　用免疫印跡方法檢測ER應激相關蛋白時發(fā)現，OGD/R組SH-SY5Y細胞ER應激相關蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、MANF的表達均明顯高于NC組，給予重組人MANF蛋白處理后，由OGD/R上調的GRP78/BiP和CHOP的表達量均有所降低。
　　4. OGD/R誘導的促凋亡蛋白表達

20、及MANF的作用
　　OGD/R組促凋亡蛋白CHOP表達增加，該結果提示OGD/R可能誘導了凋亡性的ER應激。為了進一步驗證該結果，我們對Caspase-3進行了檢測，結果發(fā)現，與NC組比較，激活性的Caspase-3水平也顯著增加。這些結果提示OGD/R可誘導凋亡性ER應激。同時發(fā)現，給予重組人MANF蛋白干預后，由OGD/R上調的CHOP和cleaved caspase-3的水平被抑制。
　　結論：
　　1. OG