小鼠脊髓損傷后microRNA的表達變化及miR-124低表達和高表達轉基因小鼠的建立.pdf

1、脊髓損傷是一種致殘率高、愈后差的疾病，患者多伴有終身殘疾。近年來我國脊髓損傷的發(fā)病率呈明顯逐年遞增趨勢，每年新增脊髓損傷患者超過6萬人，但是臨床上針對脊髓損傷病人卻缺乏有效的治療手段。長期以來人們一直認為脊髓損傷后神經纖維是不能再生的，但是近來的研究結果表明，只要克服中樞神經系統(tǒng)不利軸突生長的微環(huán)境，損傷后脊髓中的神經纖維是可以再生的。目前對脊髓損傷修復的關鍵分子及機制仍然不清楚，因此探索與脊髓損傷修復相關的新分子及其作用機制，對今后脊

2、髓損傷的治療至關重要。
　　miRNA是一類長度為22個核苷酸左右非編碼的微小單鏈RNA，它通過多種機制調控靶mRNA的表達。人體內約有1000個miRNA，調控超過1/3的編碼基因，影響著幾乎所有的信號通路。現(xiàn)有的研究結果表明：多種miRNA在中樞神經系統(tǒng)廣泛表達，它們在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育和功能維持上扮演著非常重要的角色。一些miRNA在腦缺血、創(chuàng)傷性腦病、脊髓損傷、阿爾茨海默病、亨廷頓氏病、帕金森病等中樞神經系統(tǒng)疾病中出現(xiàn)表達上

3、調或下調，提示這些miRNA可能在上述疾病的病理生理過程中發(fā)揮作用。
　　本課題采用Agilent Mouse miRNA基因芯片，檢測了正常C57BL/6小鼠以及脊髓重度夾傷后1d、3d、7d、14d、21d、28d時脊髓組織中miRNA表達譜的變化。miRNA基因芯片結果顯示：有11個miRNA在脊髓損傷后與對照組相比出現(xiàn)差異性表達，其中miR-21在損傷后3d、7d、14d表達上調；miR-142-3p和miR-223在損傷

4、后3d、7d表達上調；miR-146a在損傷后14d、21d、28d表達上調；miR-199b在損傷后7d表達上調；而 miR-1在損傷后7d、14d、21d、28d表達下調；miR-133a和miR-133b在損傷后21d、28d表達下調；miR-150和miR-486在損傷后7d表達下調。隨后我們運用qRT-PCR技術對這些miRNA在脊髓損傷后的表達情況進行了驗證，檢測結果與基因芯片的結果一致。
　　出乎我們預期的是中樞神經

5、系統(tǒng)表達最豐富的miR-124在脊髓損傷前后并未發(fā)現(xiàn)有明顯的表達上調或下調，我們推測有可能和我們在送檢芯片時選取的脊髓長度有關。我們用原位雜交的方法進行了miR-124全腦切片和脊髓的染色，發(fā)現(xiàn) miR-124在小鼠的嗅球、海馬、大腦皮層、小腦腳、脊髓灰質等神經元聚集區(qū)有著大量的表達。我們取脊髓夾傷后1d、3d、7d的損傷段脊髓（長度為0.8cm）進行總RNA的提取，通過qRT-PCR對miR-124的表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)miR-1

6、24在損傷后1d、3d、7d均出現(xiàn)顯著性的表達下調。隨后我們對脊髓損傷后7d的切片進行了miR-124原位雜交和NeuN免疫組化的雙標記，結果顯示：損傷中心區(qū)域，無NeuN和miR124的表達；損傷中心的周邊區(qū)域，可以見到只表達NeuN，而無miR-124表達的神經元；正常的脊髓神經元則呈 NeuN和miR-124雙標記。該結果表明miR-124和神經元的損傷狀態(tài)密切相關，提示我們miR-124可能參與了脊髓神經元功能可塑性的調節(jié)，可能

7、在脊髓損傷修復的過程中發(fā)揮作用。
　　通過生物信息學網站的檢索，我們發(fā)現(xiàn) miR-124可能調控的靶基因近千個，與中樞神經系統(tǒng)密切相關的靶基因就達近百個，如果我們對這些靶基因逐一進行驗證，那工作量無疑將是巨大的。因此，采用遺傳學手段，去除miR-124基因的功能，無疑是一個非常有效的研究手段。目前miRNA基因功能缺失的研究中主要采用三種方法：基因敲除、反義寡核苷酸抑制劑和miRNA海綿，基因敲除無疑是研究一個基因功能最好的手段，

8、但由于編碼miR-124的基因位于3個不同染色體上，因此敲除掉miR-124將異常困難；通過局部注射 miR-124的反義寡核苷酸抑制劑僅僅能產生瞬時抑制的作用，并不適合脊髓損傷這樣一個慢性疾病的研究。因此我們選擇了miRNA海綿的方法去敲低（knock-down）miR-124的功能。miRNA海綿載體上一般包含7-10個與目的miRNA反向互補的重復序列，它可以與體內成熟的miRNA互補結合從而抑制miRNA的功能。首先，我們合成了

9、帶有miR-1247個反向互補序列的質粒，隨后將這段序列亞克隆到pEGFP-C3和pMIR-report兩種報告基因載體上，構建好的海綿載體分別命名為pEGFP-miR-124sp和pMIR-miR-124sp。通過酶切驗證、測序等方法，對重組質粒進行鑒定。pEGFP-miR-124sp載體上帶有綠色熒光蛋白報告基因，而pMIR-miR-124sp載體上帶有熒光素酶報告基因。我們利用這兩種檢測系統(tǒng)各自的特點，在培養(yǎng)的COS-7細胞系中去

10、驗證miR-124海綿轉染后抑制miR-124的特異性和有效性。當我們把miR-124 mimic（miR-124的人工合成物）與報告基因載體pMIR-miR-124sp共轉染時發(fā)現(xiàn)，COS-7細胞中熒火蟲熒光素酶的活性與對照組相比出現(xiàn)了顯著性的下調，熒光素酶的活性被抑制了90％。而挽救實驗證實當我們把pEGFP-miR-124sp、pMIR-miR-124sp與miR-124 mimic共轉染時，螢火蟲熒光素酶的表達則基本不受影響。當

11、我們把miR-124 mimic與pEGFP-miR-124sp熒光海綿載體共轉染COS-7細胞后，在顯微鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)，COS-7細胞中綠色熒光蛋白的表達強度較對照組出現(xiàn)了明顯的降低；同時流式細胞檢測結果也顯示表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)量明顯減少。我們用兩種實驗方案都得到了相似的實驗結果，這強烈的提示我們 miR-124海綿確實可以在 COS-7細胞中將轉染進的miR-124“吸附”掉，從而在細胞內發(fā)揮Knock-down miR-12

12、4的作用。
　　進而，我們構建了高表達miR-124前體的載體pCIG-miR-124，將構建好的載體和空載體pCIG轉染Hela細胞后，兩者均可以在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達，經過 qPCR定量后發(fā)現(xiàn)轉染 pCIG-miR-124的Hela細胞較轉染pCIG的Hela細胞內miR-124的表達量顯著的升高，說明pCIG-miR-124能成功表達成熟的miR-124。然后，我們采用小鼠受精卵顯微注射的轉基因方法，利用抑制

13、miR-124表達的pEGFP-miR-124sp海綿載體和高表達miR-124的pCIG-miR-124載體，獲得了9只EGFP表達陽性的miR-124low轉基因小鼠和6只EGFP表達陽性的miR-124high轉基因小鼠，并分別在小鼠脊髓切片上觀察到了低表達EGFP和高表達EGFP的熒光信號，初步說明了這兩種轉基因小鼠構建成功。我們期望通過建立可以使外源基因穩(wěn)定遺傳下去的小鼠品系，為進一步闡明脊髓損傷后miR-124的功能及分子機