miR-505轉(zhuǎn)基因小鼠基因表達(dá)量的檢測(cè)及生理性狀的觀(guān)測(cè).pdf

1、性發(fā)育(puberty)是哺乳動(dòng)物個(gè)體性成熟并獲得生殖能力的過(guò)程，受到遺傳、環(huán)境等多種因素的影響。下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)控制著人類(lèi)生殖系統(tǒng)的發(fā)育、成熟及功能的維持，對(duì)哺乳動(dòng)物性發(fā)育起著決定性的作用，其所分泌的各種激素水平直接影響或控制青春期發(fā)育。在正常情況下，人類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育到一定時(shí)期時(shí)，隨著下丘腦—垂體—性腺軸(HPGA)的成熟，啟動(dòng)青春期的發(fā)育，但其確切的分子機(jī)制尚不明確。
　　近年來(lái)，很多人利用小鼠對(duì)性發(fā)育機(jī)制進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)

2、室從2004年開(kāi)始，從400多種近交品系小鼠品系中，篩選出兩個(gè)性發(fā)育啟動(dòng)時(shí)間有明顯差異，全基因組及線(xiàn)粒體背景已知的近交品系小鼠C3H/HeJ和C57BL/6J作為親本雜交產(chǎn)生F2代，全基因組STR掃描和遺傳分析結(jié)果顯示，在6號(hào)、13號(hào)和X染色體得到了與雌鼠陰門(mén)開(kāi)啟時(shí)間相關(guān)的區(qū)段，其中X染色體上的～25cM(DXMit103-DXMit119，LOD=3.86)的QTL區(qū)段是顯著相關(guān)且首次發(fā)現(xiàn)的，遺傳效應(yīng)為C57BL/6J顯性、C3H/H

3、eJ隱性。針對(duì)小鼠X染色體初步定位的QTL區(qū)段構(gòu)建數(shù)個(gè)特異性區(qū)段同類(lèi)系，利用STR和SNP位標(biāo)進(jìn)行基因分型，并結(jié)合表型鑒定，在N7代家系中將小鼠性發(fā)育QTL區(qū)段縮短到X染色體rs13483770-rs29055848之間1cM的范圍內(nèi)，最終將候選基因定位在了miR-505。
　　miR-505是非編碼的內(nèi)源性小分子RNA，初級(jí)體只有90bp，成熟體有兩種狀態(tài)，分別為miR-505-3P和miR-505-5P。其能在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)

4、節(jié)靶mRNA表達(dá)。在正常狀態(tài)下，miR-505-5P在RNA水平的表達(dá)量高于miR-505-3P。
　　本課題組為深入研究miR-505對(duì)性發(fā)育的影響，構(gòu)建了全cDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　本研究基于stem-loop逆轉(zhuǎn)錄引物建立實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)成熟的miRNA;和基于絕對(duì)定量法的qRT-PCR檢測(cè)microRNA的前體和初級(jí)體。Stem-loop qRT-PCR通過(guò)改進(jìn)的莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄方案，采用相對(duì)定量的方法對(duì)樣本進(jìn)

5、行分析。用以檢測(cè)前體和初級(jí)的qRT-PCR方案，采用絕對(duì)定量的分析方法，分別檢測(cè)出前體和初級(jí)體的初始拷貝數(shù)。利用該技術(shù)檢測(cè)miR-505在轉(zhuǎn)基因小鼠及其對(duì)照品系C57BL/6J中在5、15、25、35四個(gè)不同日齡下，丘腦、垂體、卵巢、肌肉、脂肪五個(gè)不同組織中miR-505表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示:在不同日齡不同組織中，pri-miR-505的表達(dá)量都非常地低，只有幾十拷貝;但是在5和15日齡下，pre-miR-505初始拷貝數(shù)在轉(zhuǎn)基因小

6、鼠不同組織中均比C57BL/6J高約10多倍。在成熟狀態(tài)下，miR-505-5P除丘腦組織外，在垂體、卵巢、肌肉和脂肪組織中，其相對(duì)表達(dá)量基本上都大于1，尤其在卵巢和脂肪組織中，在5和15天日齡下，其相對(duì)表達(dá)量更是高達(dá)4左右。miR-505-3P其在位于性發(fā)育軸上的丘腦、垂體、卵巢組織中，相對(duì)表達(dá)量基本上都在1左右。
　　同時(shí)，本研究鑒定了miR-505轉(zhuǎn)基因小鼠及近交系品系C57BL/6J的表型，包括:陰門(mén)開(kāi)啟、角質(zhì)化和生長(zhǎng)曲線(xiàn)

7、，發(fā)現(xiàn)均無(wú)顯著性差異。
　　綜上所述，本研究成功的構(gòu)建了檢測(cè)microRNA前體和成熟體的經(jīng)濟(jì)實(shí)用、靈敏、高效的檢測(cè)方案;利用該技術(shù)對(duì)不同日齡、不同組織的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-505的前體是明顯提高的，但是成熟體在性發(fā)育相關(guān)丘腦-垂體-性腺軸上并沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)，表明轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建是成功的，但在基因表達(dá)水平上并沒(méi)有顯現(xiàn)出來(lái);同時(shí)，由miR-505-3P和miR-505-5P在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)量的差