HIV-P24核酸適配體的篩選.pdf

1、核酸適配體是通過SELEX技術(shù)篩選得到的一類寡核苷酸分子，能與靶分子強(qiáng)特異、高親和力地結(jié)合，并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。由于其具有靶分子范圍廣、分子質(zhì)量小、免疫原性低、易于化學(xué)合成、改造和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，核酸適配體在臨床診斷和疾病治療領(lǐng)域中顯現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。P24蛋白是1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的核心抗原，可作為HIV感染窗口期檢測(cè)的血清標(biāo)志物，血液中P24的測(cè)定在臨床醫(yī)學(xué)中也是艾滋病病情監(jiān)控的一個(gè)重要指標(biāo)。本課題利用SELEX技術(shù)篩選H

2、IV-P24特異性核酸適配體，為建立核酸適配體輔助的P24檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，對(duì)艾滋病的診斷和治療具有重要意義。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，我們以重組HIV-P24為特異靶標(biāo)，利用消減SELEX的策略從隨機(jī)寡核苷酸庫中篩選能與P24結(jié)合的寡核苷酸，并通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證篩選到的次級(jí)庫寡核苷酸與P24的結(jié)合。通過酶切、連接反應(yīng)，將已獲得的與P24結(jié)合的次級(jí)庫寡核苷酸與載體pMD18-T構(gòu)建成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109

3、形成單克隆以分離不同序列的寡核苷酸。利用不對(duì)稱PCR制備寡核苷酸ssDNA，通過斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)(Dot-blot)篩選與P24強(qiáng)結(jié)合的寡核苷酸，并檢測(cè)核酸適配體識(shí)別P24的特異性。
　　 經(jīng)過12輪的SELEX篩選，獲得了針對(duì)HIV-P24富集的次級(jí)寡核苷酸庫。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)顯示，篩選到的寡核苷酸與P24結(jié)合。Dot-blot篩選到7條與P24有較強(qiáng)結(jié)合能力的寡核苷酸。特異性檢測(cè)顯示，18和27號(hào)適配體只與P24特異性結(jié)合，與人血清