共培養(yǎng)條件下脂肪干細(xì)胞成骨能力的改變.pdf

1、目的：
　　以體外培養(yǎng)的經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（iASCs）為研究對(duì)象，觀察iASCs分別與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(PDMSCs)共同培養(yǎng)時(shí)，iASCs成骨能力的變化。初步探究體內(nèi)MSCs對(duì)骨祖細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　材料和方法：
　　1、ASCs提取無菌條件下吸取新鮮的人皮下吸脂術(shù)所得的脂肪組織20mL， PBS沖洗，向脂肪組織懸液中加入I型膠原

2、酶進(jìn)行震蕩消化，通過貼壁法獲得原代ASCs。DMEM/F-12培養(yǎng)液中原代培養(yǎng)7天，每3天換液一次，融合度達(dá)到70％-80%時(shí)傳代，應(yīng)用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)。
　　2、cck-8檢測(cè)ASCs、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs在0-7天時(shí)的增殖曲線。
　　3、實(shí)驗(yàn)分組直接共培養(yǎng)組：取生長(zhǎng)良好的第3代 ASCs，于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進(jìn)行7天誘導(dǎo)（iASCs）。經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整

3、 iASCs密度至2×104/ml。將 BMSCs、UC-MSCs和 PDMSCs，0.25%胰酶消化，調(diào)整各 MSCs密度至1×104/ml。將100μL iASCs分別與100μL的BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs混合加入96孔板，設(shè)實(shí)驗(yàn)組，即為d-BMSCs組、d-UC-MSCs組和d-PDMSCs組，每組設(shè)6復(fù)孔。對(duì)照組為3×103個(gè)iASCs單獨(dú)接種于96孔板，所設(shè)復(fù)孔數(shù)如實(shí)驗(yàn)組。在不同的時(shí)間間期，檢測(cè)各組細(xì)胞磷酸酶活

4、性和濃度。另設(shè)上述四組細(xì)胞，每組6孔，檢測(cè)不同時(shí)間間期各組細(xì)胞礦化基質(zhì)形成情況。所有細(xì)胞在24h后更換為礦化培養(yǎng)液。
　　間接共培養(yǎng)組：生長(zhǎng)良好的 iASCs經(jīng)消化后，細(xì)胞密度如上組。將100μL iASCs含細(xì)胞2×103個(gè)加入96孔板中，分別用BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，即為 ind-BMSCs組、ind-UC-MSCs組和ind-PDMSCs組，24h后各組更換為相對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)液。

5、對(duì)照組為2×103個(gè)iASCs培養(yǎng)于96孔板，為ind-iASCs。上述四組細(xì)胞，每組6孔，檢測(cè)各組細(xì)胞磷酸酶活性和濃度。另設(shè)上述四組細(xì)胞，每組6孔，檢測(cè)不同時(shí)間間期各組細(xì)胞礦化基質(zhì)形成情況。
　　4、檢測(cè)分析將上述96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于第3,5,7,10,12,14天的同一時(shí)間點(diǎn)，每組取6孔，利用堿性磷酸酶試劑盒操作要求測(cè)定四組細(xì)胞光密度（OD）值，計(jì)數(shù)其堿性磷酸酶濃度和活性。
　　分別于第7,10,12,1

6、4天的同一時(shí)間點(diǎn)，每組取6孔，利用茜素紅進(jìn)行染色。同時(shí)利用茜素紅染料可溶于氯化十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride，CPC）溶液重新析出的特點(diǎn)，定量分析礦化基質(zhì)形成情況。
　　實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、對(duì)于提取的ASCs，細(xì)胞具有類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)，具有典型的MSCs相關(guān)表面

7、分子，同時(shí)具有向中胚層組織分化的潛能。BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs與 ASCs具有相似的形態(tài)。通過繪制增殖曲線可知，增值能力UC-MSCs>PDMSCs>ASCs> BMSCs。
　　2、ALP表達(dá)情況，不同組織來源的MSCs表現(xiàn)有差別。在直接共培養(yǎng)時(shí)， BMSCs促進(jìn)iASCs表達(dá)ALP的能力最強(qiáng)，其表達(dá)水平和活性均為最高，顯著高于其他兩種 MSCs。UC-MSCs組和 PDMSCs組表現(xiàn)相近。在間接共培養(yǎng)時(shí)， UC

8、-MSCs和PDMSCs條件培養(yǎng)液促進(jìn)iASCs表達(dá)ALP的能力強(qiáng)于BMSCs。
　　3、礦化基質(zhì)形成情況，不同組織來源的MSCs同樣表現(xiàn)不同。共培養(yǎng)時(shí)各實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組。在直接共培養(yǎng)時(shí)，PDMSCs組在各時(shí)間點(diǎn)礦化基質(zhì)形成最多，UC-MSCs組礦化基質(zhì)形成多于 BMSCs組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在間接共培養(yǎng)組中，UC-MSCs條件培養(yǎng)液組礦化基質(zhì)形成多于BMSCs和PDMSCs條件培養(yǎng)液組，PDMSCs條件培養(yǎng)液組多于BMSCs條

9、件培養(yǎng)液組。
　　結(jié)論：
　　1、采用膠原酶消化法獲得的皮下脂肪來源的ASCs具有MSCs的特征。
　　2、皮下脂肪來源的ASCs具有與BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs相似的細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)方式和增殖特性。
　　3、ASCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7天后獲得的iASCs具有與骨祖細(xì)胞（成骨細(xì)胞前體）相似的特征，可為骨組織工程研究提供充足的細(xì)胞來源。
　　4、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs均可促進(jìn)iASCs

10、向成骨細(xì)胞分化。又有各自不同的特點(diǎn)：BMSCs可促進(jìn)并維持iASCs高表達(dá)ALP，使iASCs處于成骨早期階段；UC-MSCs和 PDMSCs在促進(jìn) ALP表達(dá)方面能力弱于 BMSCs，但UC-MSCs和 PDMSCs可加快 iASCs向成骨細(xì)胞分化的速度，并可促進(jìn) iASCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)。
　　5、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs通過直接或間接接觸均可調(diào)節(jié)iASCs向成骨細(xì)胞分化，但其中直接接觸調(diào)節(jié)起主要作用，直接接觸