硒化鎘量子點(diǎn)對(duì)人成纖維上皮細(xì)胞的毒理學(xué)研究.pdf

1、[目的]
　　 半導(dǎo)體納米粒子-量子點(diǎn)(Quantum dot,Qdot)是一種新型的納米材料,其半徑小于或接近于激子玻爾半徑的納米微粒,又稱半導(dǎo)體納米晶(semiconductor nanocrystal)。量子點(diǎn)一直是材料、電子、物理等學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),近年來(lái)由于其具有獨(dú)特的光譜特征、良好的生物相容性。加上可適應(yīng)性和高通量的分子識(shí)別等特性,在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)展。
　　 量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光特性使之可以

2、用于熒光標(biāo)記,進(jìn)而成為一類理想的生物熒光探針。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。量子點(diǎn)的具體應(yīng)用主要在于:可以在細(xì)胞水平成像,觀察細(xì)胞器的各種狀態(tài);可以進(jìn)行生物分子多組分的測(cè)定,對(duì)干擾的雜質(zhì)分子有很好的消除作用;可以對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,從而檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用等等。當(dāng)然量子點(diǎn)在生物體系中的應(yīng)用遠(yuǎn)不止這些,它還可以應(yīng)用于生物芯片、溶液矩陣、醫(yī)學(xué)成像等方面。
　　 可以看到,量子點(diǎn)的生物學(xué)應(yīng)用基本上都是基于量子點(diǎn)對(duì)生物細(xì)胞無(wú)害的假設(shè)上面

3、。目前關(guān)于量子點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)以及其藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)的研究還處于起步階段,文獻(xiàn)報(bào)道也主要是一些觀察性報(bào)道,如觀測(cè)量子點(diǎn)在靜脈注射后位于體內(nèi)的分布以及不同包被修飾后量子點(diǎn)的代謝情況。但是,在分子水平上量子點(diǎn)是否對(duì)細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生影響,尤其是對(duì)人體細(xì)胞的影響如何則更是值得人們關(guān)注的。
　　 一個(gè)化合物對(duì)細(xì)胞在分子水平的影響可從其對(duì)細(xì)胞中最重要的兩大類物質(zhì)即蛋白質(zhì)和DNA的影響來(lái)研究。對(duì)DNA的干擾是許多化合物導(dǎo)致細(xì)胞生理功能改變的

4、主要途徑,如對(duì)堿基的修飾,造成DNA單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs),雙鏈斷裂(double strand breaks,DSBs),鏈間或鏈內(nèi)的交聯(lián)(cross-link)等。由于對(duì)DNA的損傷可影響到遺傳性狀的改變,因此這種DNA損傷功能的特性被稱為“遺傳毒性”。在各種DNA損傷中,DSBs被認(rèn)為是最嚴(yán)重的一種。
　　 研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在受到DNA損傷尤其是DNA雙鏈斷裂損傷后,在DNA雙鏈斷裂位

5、點(diǎn)會(huì)發(fā)生一種H2AX蛋白的磷酸化。作為與真核細(xì)胞DNA相結(jié)合的組蛋白成分。H2AX的C端結(jié)構(gòu)域中舍有一個(gè)Set殘基,當(dāng)DSBs出現(xiàn)時(shí).該殘基被磷酸化(稱為γH2AX)。γH2AX進(jìn)一步募集其它DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白到損傷位點(diǎn),形成“焦點(diǎn)”結(jié)構(gòu),對(duì)DNA損傷進(jìn)行感受和修復(fù),因此是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的重要成員。由于γH2AX的出現(xiàn)與DSBs緊密相關(guān),γH2AX成為檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷的一個(gè)新的特異性指標(biāo)。
　　 一些有研究顯示,以鎘硒或者

6、鎘碲為核心的量子點(diǎn)毒性部分來(lái)源于在溶液中游寓的鎘元素或者進(jìn)入細(xì)胞后釋放的鎘元素。另一方面,以鎘硒或者鎘碲為材料的量子點(diǎn)具有光致氧化和空氣致氧化性,由此產(chǎn)生的自由基可能成為量子點(diǎn)毒性產(chǎn)生的又一大機(jī)制。為了增加量子點(diǎn)的穩(wěn)定性.拓寬其應(yīng)用范圍以及減小核心材料的副作用,研究人員在鎘硒或者鎘碲量子點(diǎn)外層加上不同的包裹材料,以期減少可能的鎘元素釋放以及增加生物兼容性。ZnS是比較普遍應(yīng)用的材料之一。它可以改善因?yàn)殒k硒碲等元素未滿電子層軌道所致的不穩(wěn)

7、定性。從而增強(qiáng)熒光效率。合成之初,量子點(diǎn)親水性較差,研究人員通過(guò)運(yùn)用巰基丙酸(mercaptopropionicacid)和多聚乙二醇(polyethyleneglycol)(PEG)來(lái)增加量子點(diǎn)的水溶性并防止納米顆粒的聚集。
　　 鑒于以上原因。我們擬對(duì)量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性進(jìn)行深入研究。本課題選用人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)為靶細(xì)胞,分別檢測(cè)CdSeQDs以及有PEG包被的CdSeQDs對(duì)HSF細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用:選用γH

8、2AX為檢測(cè)指標(biāo),運(yùn)用免疫熒光技術(shù)研究這兩種材料對(duì)HSF細(xì)胞的DNA損傷作用;通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證材料的遺傳毒性作用。使用熒光探針DCF檢測(cè)ROS水平,探討其在DNA損傷中的作用。為量子點(diǎn)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的影響提供毒理學(xué)依據(jù)以及探討其相應(yīng)的機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)和量子點(diǎn)處理:HSF細(xì)胞培養(yǎng)于lO％小牛血清、0.03％L-谷氨酰胺、104U·L-1青霉素、125mg·L-1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中

9、。細(xì)胞傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),分別加入量子點(diǎn)440、680,使每組培養(yǎng)液中量子點(diǎn)終濃度分別達(dá)到8nM和80nM,于37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)2、8和24h。對(duì)照組用相同體積的等量PBS處理細(xì)胞。
　　 2、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：1)MTS比色法:用96孔板,分別用量子點(diǎn)440和680進(jìn)行2，8和24h處理,每板內(nèi)分為空白組(未經(jīng)量子點(diǎn)處理）、量子點(diǎn)8nM、80nM處理組、試劑對(duì)照。細(xì)胞分別培養(yǎng)到相應(yīng)的處理時(shí)間點(diǎn)后,加5g·L-1MTS2

10、0μl,37℃條件下繼續(xù)孵育45分鐘,終止培養(yǎng)。選擇490波長(zhǎng),在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A490)。
　　 2)臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn):取75μl混有細(xì)胞的培養(yǎng)液,用75μl稀釋濃度為O.4％的臺(tái)盼蘭與之混勻,取50μl混合液,滴于計(jì)數(shù)板上,于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。
　　 3、γH2AX檢測(cè):
　　 1)免疫熒光:用量子點(diǎn)處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后通過(guò)免疫熒光手段檢測(cè)γH2AX在細(xì)胞核內(nèi)分布情況。
　　 2)Weste

11、rnblot:量子點(diǎn)處理后的細(xì)胞用westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)γH2AX蛋白的表達(dá)情況。
　　 4、彗星實(shí)驗(yàn):細(xì)胞用量子點(diǎn)處理績(jī)束后,離心收集,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至6×1010L-1。制備“三明治”凝膠。依次進(jìn)行裂解、25V電泳、DAPI染色,在熒光顯徼鏡下觀察結(jié)果。
　　 5、ROS機(jī)理檢測(cè):在細(xì)胞處理結(jié)束后,用O.25％胰酶消化后,PBS重懸,加入DCFH-DA調(diào)至工作液濃度(20μM),避光孵育30min后,用

12、酶標(biāo)儀在激發(fā)波485nm處進(jìn)行檢測(cè)。6、雙向電泳:HSF細(xì)胞用PEG包裹的量子點(diǎn)在8nM或80nM處理24小時(shí)后,提取蛋白進(jìn)行雙向電泳。
　　 [結(jié)果]
　　 1、無(wú)PEG包裹的量子點(diǎn)680在80nM濃度下作用24小時(shí)顯著影響細(xì)胞生存率。MTS實(shí)驗(yàn)顯示,用有PEG包裹的量子點(diǎn)680和440在8nM和80nM條件下處理細(xì)胞24小時(shí),細(xì)胞與對(duì)照組無(wú)顯著差異。而沒(méi)有PEG包裹的這兩種量子點(diǎn)在高濃度下作用于細(xì)胞8小時(shí)后開(kāi)始顯示出

13、對(duì)細(xì)胞生存率的負(fù)面作用。臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明8nM濃度下沒(méi)有PEG修飾的量子點(diǎn)680和440在24小時(shí)觀察時(shí)間內(nèi)對(duì)HSF細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響:而量子點(diǎn)680在高劑量情況下顯示出細(xì)胞毒性,活細(xì)胞數(shù)量顯著降低。
　　 2、未經(jīng)PEG修飾的量子點(diǎn)在高濃度劑量下可引起γH2AX焦點(diǎn)形成。γH2AX焦點(diǎn)是檢測(cè)DNA損傷的敏感指標(biāo)之一。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示量子點(diǎn)440和680在有PEG包裹的情況下在24小時(shí)內(nèi)形成的γH2AX焦點(diǎn)與陰性對(duì)照組相比

14、并沒(méi)有明顯區(qū)別。而暴露于高劑量量子點(diǎn)下的HSF出現(xiàn)γH2AX焦點(diǎn)的數(shù)量呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。Westernblot同時(shí)驗(yàn)證了這種趨勢(shì)。
　　 3、中性彗星實(shí)驗(yàn)表明無(wú)PEG修飾的量子點(diǎn)可引起DNA雙鍵斷裂。
　　 4、ROS是量子點(diǎn)引起γH2AX焦點(diǎn)的原因之一。
　　 5、有PEG修飾的量子點(diǎn)440和680對(duì)于蛋白表達(dá)水平的改變幾乎沒(méi)有影響。
　　 [結(jié)論]
　　 1、PEG是較好的減少量子點(diǎn)細(xì)胞毒性的