補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA及其Smads信號通路的影響.pdf

1、目的:前期研究證實，補腎法、疏肝法具有提高體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)患者臨床妊娠率、改善妊娠結(jié)局、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用，本研究擬通過觀察補腎法、疏肝法對IVF-ET患者體外培養(yǎng)卵巢壁顆粒細(xì)胞ACTA及其信號通路的調(diào)控作用，以探討兩法促進卵泡發(fā)育、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量作用機制及其途經(jīng)的異同。
　　方法:
　　1、含藥血清制備
　　補腎調(diào)經(jīng)

2、方、逍遙散方含藥血清:選取年齡在20-30歲，身體健康，月經(jīng)規(guī)律，B超顯示有成熟卵泡，且無卵巢、子宮器質(zhì)性疾病的女性志愿者10名，分別服用補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙散方。補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方服用方法是每日1劑，300ml，早晚分服。補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙散方連續(xù)服藥3天，第4天清晨空腹服用全天劑量藥物(服藥前禁食12h)，于末次服藥1h后靜脈取血5ml，室溫靜置2h，3000r/min離心10min，取上清，56℃水浴30 min滅活補體，0.22μm

3、無菌濾器過濾除菌、分裝制備補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方兩種人含藥血清。
　　正常血清:選取年齡在20-30歲，身體健康，月經(jīng)規(guī)律，B超顯示有成熟卵泡，且無卵巢、子宮器質(zhì)性疾病的女性志愿者5名，清晨空腹靜脈采血5ml，同上制備正常人血清，設(shè)為正常血清對照。
　　以上血清均-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2、卵巢壁顆粒細(xì)胞培養(yǎng)
　　將含有顆粒細(xì)胞的卵泡液經(jīng)梯度離心后獲得壁顆粒細(xì)胞，于35mm培養(yǎng)皿中置2ml培養(yǎng)液，37℃、5％CO2

4、(V/V)、100％濕度培養(yǎng)，24h后細(xì)胞貼壁。分別加入補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸含藥血清，分為補腎組和疏肝組，補腎含藥血清組與疏肝含藥血清組分別設(shè)置低、中、高三個劑量組，正常血清為正常組，不加血清為空白組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集顆粒細(xì)胞。第一批采用機械方法收集顆粒細(xì)胞，置于-80℃保存?zhèn)溆茫ㄓ糜趯崟r熒光定量PCR)。第二批采用機械與酶結(jié)合的方法，迅速放入2％多聚甲醛中固定（分別用于免疫組化和免疫熒光）。補腎高劑量組與疏肝高劑量組在中藥孵育24

5、h后，加入SB431542（濃度為10μmol/L），繼續(xù)孵育2h，分別為補腎阻斷劑組和疏肝阻斷劑組，收集與實驗方法同上。
　　采用實時熒光定量PCR檢測ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá);采用免疫組化法、免疫熒光法檢測顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4以及P-Smad2、P-Smad3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、體外培

6、養(yǎng)各組卵巢壁顆粒細(xì)胞ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)
　　1.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達(dá)比較
　　正常組較空白組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。與空白組、正常組比較，疏肝低、中、高劑量組顆粒細(xì)胞中A

7、CTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)均升高（均P＜0.05）;且疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)高于疏肝中劑量組及疏肝低劑量組（均P＜0.05）;疏肝中劑量組表達(dá)高于疏肝低劑量組(P＜0.05)，呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較，補腎低、中、高劑量組的顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4

8、mRNA表達(dá)升高（均P＜0.05）;且補腎高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)較補腎中、低劑量組均升高(均P＜0.05)，呈劑量依賴性。
　　疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較，補腎高劑量組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡ B、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4mRNA的表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），其余各組表達(dá)由高至低依次是補腎中劑量組、

9、疏肝高劑量組、疏肝中劑量組、補腎低劑量組、疏肝低劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　1.2疏肝、補腎阻斷劑組與非阻斷劑組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)比較
　　與疏肝阻斷劑組比較，疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)明顯升高（均P＜0.05）;疏肝中劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、S

10、mad3、Smad4 mRNA表達(dá)無差異（P＞0.05）;空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)下降(均P＜0.05)。與補腎阻斷劑組比較，補腎高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達(dá)明顯升高(均P＜0.05);補腎中劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)無差異(P＞0

11、.05);空白組、正常組與補腎低劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達(dá)下降(均P＜0.05)。
　　2、各組之間體外培養(yǎng)卵巢壁顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白盼表達(dá)
　　2.1免疫組化結(jié)果
　　2.1.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、S

12、mad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較
　　正常組與空白組之間比較，正常組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)均高于空白組(均P＜0.05)。
　　與空白組、正常組比較，疏肝低、中、高劑量組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高（均P＜

13、0.05）;且疏肝高劑量組蛋白表達(dá)最高，其次為疏肝中、低劑量組，呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較，補腎低、中、高劑量組的顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05）;且補腎高劑量組蛋白表達(dá)最高，其次為補腎中劑量組和補腎低劑量組，呈劑量依賴性。
　　疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較，補腎高劑量組較疏肝高劑量組ACTA、

14、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05），補腎中劑量組較疏肝中劑量組蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05），補腎低劑量組與疏肝低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.1.2疏肝、補腎阻斷劑組與非阻斷劑各組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較
　　與疏肝

15、阻斷劑組比較，疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)明顯升高(均P＜0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05）;空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表

16、達(dá)下降(均P＜0.05)。與補腎阻斷劑組比較，補腎高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、 Smad4蛋白表達(dá)明顯升高（均P＜0.05）;補腎中劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05）;空白組、正常組與補腎低劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2

17、、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)下降(均P＜0.05)。
　　2.2細(xì)胞免疫熒光結(jié)果
　　2.2.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較
　　正常組與空白組之間比較，正常組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)均高于空白組

18、(均P＜0.05)。
　　與空白組、正常組比較，疏肝低、中、高劑量組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05）;且疏肝高劑量組蛋白表達(dá)最高，其次為疏肝中、低劑量組，呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較，補腎低、中、高劑量組的顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白

19、表達(dá)升高（均P＜0.05）;且補腎高劑量組蛋白表達(dá)最高，其次為補腎中劑量組和補腎低劑量組，呈劑量依賴性。
　　疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較，補腎高劑量組較疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05），補腎中劑量組較疏肝中劑量組蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05），補腎低劑量組與疏肝低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意

20、義(P＞0.05）。
　　2.2.2疏肝、補腎阻斷劑組與非阻斷劑各組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較
　　與疏肝阻斷劑組比較，疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)明顯升高(均P＜0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-

21、Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異（P＞0.05）;空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)下降(均P＜0.05)。與補腎阻斷劑組比較，補腎高劑量組ACTA、 ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)明顯升高(均P＜0.05);補腎中劑量組ACTA、ACTRⅡB、AL

22、K4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05）;空白組、正常組與補腎低劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)下降(均P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、逍遙散方和補腎調(diào)經(jīng)方含藥血清可以提高體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4 mRNA及蛋白的表達(dá)，增強ACTA促進卵泡生長發(fā)育

23、、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用。
　　2、逍遙散方和補腎調(diào)經(jīng)方影響ACTA信號通路的作用呈劑量依賴性，即高劑量效果最優(yōu)。
　　3、補腎調(diào)經(jīng)方含藥血清在提高體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4 mRNA及其蛋白的表達(dá)作用比逍遙散方更顯著，提示補腎調(diào)經(jīng)方促進卵泡生長發(fā)育、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)于逍遙散方。
　　4、逍遙散方和補腎調(diào)經(jīng)方可通過上調(diào)ACTA及其Smads信號通路來發(fā)揮其促進卵泡生長發(fā)育和提高卵母細(xì)胞質(zhì)量