畢赤酵母表達(dá)甘露糖化人溶菌酶研究.pdf

1、胞內(nèi)菌的治療是目前臨床醫(yī)療的難題之一。如結(jié)核分枝桿菌、沙門傷寒菌、嗜肺軍團(tuán)菌等胞內(nèi)菌，它們通常寄生在人體吞噬細(xì)胞內(nèi)，往往會(huì)對(duì)人體造成慢性持續(xù)性感染。當(dāng)這些病菌侵染人體后會(huì)被吞噬細(xì)胞吞噬，但吞噬細(xì)胞不能像裂解大腸桿菌等非胞內(nèi)菌那樣將其殺死。例如胞內(nèi)菌中的結(jié)核分枝桿菌已演化出了逃逸吞噬細(xì)胞裂解的機(jī)制，它通過阻止其所在吞噬泡的酸化進(jìn)程，來阻止吞噬泡與溶酶體的融合。這樣結(jié)核分枝桿菌就能長期寄生在胞內(nèi)，并在人體免疫能力下降時(shí)侵染周圍細(xì)胞。胞內(nèi)菌的

2、治療主要是用抗生素等抗菌藥長期療法，大多數(shù)的抗生素等抗菌藥治療胞外菌療效好，但它們很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或入胞濃度低難以殺死胞內(nèi)寄生菌，并且長期用藥也容易產(chǎn)生耐藥菌。為探索解決胞內(nèi)菌的治療難題，本研究利用畢赤酵母表達(dá)甘露糖化人溶菌酶，并利用該酶具有的甘露糖殘基是巨噬細(xì)胞表面甘露糖受體的配體這一特點(diǎn)，研究利用巨噬細(xì)胞受體與配體之間的相互作用介導(dǎo)甘露糖化人溶菌酶內(nèi)吞，以達(dá)到殺死寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)病菌的目的。
　　 巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞是人體的固

3、有免疫細(xì)胞，它們構(gòu)成人體的第二道防線。巨噬細(xì)胞能通過細(xì)胞表面受體來識(shí)別入侵機(jī)體的病原體，在眾多的表面受體中，甘露糖受體是重要的病原體模式識(shí)別受體之一。巨噬細(xì)胞能通過甘露糖受體的介導(dǎo)作用，將帶有甘露糖糖鏈修飾的病原體內(nèi)吞到胞內(nèi)。因此利用甘露糖殘基修飾的藥物靶向巨噬細(xì)胞是一條值得探索的藥物遞送途徑。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是成功的蛋白分泌表達(dá)系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)能對(duì)蛋白進(jìn)行多種翻譯后加工修飾，如能特異性在NXS/T(X為除脯氨酸以外的所有氨基酸)

4、位點(diǎn)的天冬酰胺上進(jìn)行外側(cè)鏈為甘露糖殘基的糖基化修飾。利用畢赤酵母的這一特性，可以使具有N-糖基化位點(diǎn)的蛋白進(jìn)行甘露糖化修飾。人溶菌酶具有水解細(xì)菌肽聚糖層中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡糖胺之間的β-1.4糖苷鍵能力，它能殺死革蘭氏陽性菌，在體內(nèi)的補(bǔ)體的幫助下對(duì)革蘭氏陰性菌也有一定的抑殺作用，因此具有潛在的藥用價(jià)值。但是天然的人溶菌酶沒有N-糖基化位點(diǎn)，理論上用畢赤酵母表達(dá)該蛋白也不會(huì)產(chǎn)生N-糖基化修飾。為獲得甘露糖化修飾的人溶菌酶及對(duì)其相關(guān)

5、特性的研究，本實(shí)驗(yàn)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：
　　 1、利用畢赤酵母表達(dá)甘露糖化修飾的人溶菌酶突變體本研究得到C-端融合2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)序列的人溶菌酶突變體的融合基因，并以此構(gòu)建了pPICZαA-hLYZ-myc-His載體，將該載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。得到重組菌分泌表達(dá)的蛋白通過SDS-PAGE分析顯示為一彌散的條帶，彌散蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)位于20-45kDa之間。取其中Mr最小的帶做肽指紋圖譜分析，結(jié)果該重組蛋白的

6、氨基酸序列與人源溶菌酶lysozymeprecursor(EC3.2.1.17)的氨基酸重合率達(dá)36％；Western印跡表明彌散的重組蛋白均能與鼠抗人溶菌酶單克隆抗體特異性結(jié)合；重組蛋白經(jīng)過PNGaseF酶切分析，SDS-PAGE顯示彌散條帶消失，在理論Mr附近出現(xiàn)一條分子量均一的條帶；用伴刀豆蛋白A(ConA)對(duì)該重組蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該重組蛋白可以與ConA特異性結(jié)合。以上結(jié)果表明得到的重組蛋白為甘露糖化修飾的人溶菌酶。

7、>　　 2、甘露糖化修飾的人溶菌酶可以被巨噬細(xì)胞內(nèi)化通過構(gòu)建人溶菌酶與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合蛋白的融合基因載體pPICZαA-hLYZ/eGFP，電轉(zhuǎn)GS115構(gòu)建重組菌GS115/pPICZαA-hLYZ/eGFP，該重組菌誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，通過硫酸銨沉淀、G25柱脫鹽、鎳親和層析純化獲得目的重組融合蛋白，脫去咪唑與鹽后凍干濃縮，將該重組融合蛋白與Raw264.7細(xì)胞共孵育，用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光物質(zhì)進(jìn)入Raw2

8、64.7，而在有甘露糖競爭性配體甘露聚糖存在時(shí)，觀察不到有綠色熒光物質(zhì)進(jìn)入Raw264.7細(xì)胞。此現(xiàn)象說明甘露糖化人溶菌酶能進(jìn)入巨噬細(xì)胞且這一過程是由甘露糖受體介導(dǎo)的。
　　 3、低甘露糖化糖基酵母工程菌GJK05表達(dá)人溶菌酶及其活性鑒定通過構(gòu)建pPICZαA-hLYZ載體及用作對(duì)照的載體pPICZαA-hLYZ(N/Q)，電轉(zhuǎn)化低糖基化酵母工程菌及GS115菌株，分別構(gòu)建重組菌表達(dá)重組蛋白hLYZ及hLYZ(N/Q)。用伴刀豆

9、蛋白A(ConA)檢測重組蛋白的甘露糖化修飾；平板抑菌圈法比較重組人溶菌酶的活性，發(fā)現(xiàn)GS115表達(dá)高甘露糖化的重組人溶菌酶影響了其抑菌的活性。低糖基化酵母工程菌GJK05表達(dá)的重組人溶菌酶與Raw264.7進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，激光共聚焦顯微鏡可觀察到Raw264.7細(xì)胞內(nèi)有熒光物質(zhì)。
　　 綜上述：本研究獲得了具有活性的甘露糖化的重組人溶菌酶，該重組蛋白具有體外抑菌活性，并且能夠在巨噬細(xì)胞表面的甘露糖受體的介導(dǎo)下進(jìn)入巨噬細(xì)胞，為