IL-6及低氧對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤總數(shù)的70％，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma Multiforme，GBM，WHOⅣ級)是惡性程度最高的組織學(xué)類型，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點(diǎn)。近年來，無論是顯微手術(shù)、放化療還是免疫治療均取得了巨大進(jìn)步，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后仍然很不理想，兩年總體生存率僅有27％。腫瘤細(xì)胞沿腦白質(zhì)束浸潤性生長是腦膠質(zhì)瘤易于復(fù)發(fā)、難以根治

2、的根本原因，因此闡明膠質(zhì)瘤侵襲性生長的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制，將有助于發(fā)現(xiàn)抗膠質(zhì)瘤侵襲的治療靶點(diǎn)，改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。細(xì)胞侵襲遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附與脫離、細(xì)胞侵襲性結(jié)構(gòu)的形成及細(xì)胞骨架變形等多個(gè)方面。其中細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程曾被認(rèn)為是細(xì)胞侵襲的限速環(huán)節(jié)，該過程由各種蛋白水解酶類完成，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)最受重視，被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)降解

3、過程中的主要蛋白水解酶。MMP2及MMP9是MMPs家族中兩個(gè)最重要的成員，因?yàn)榭梢苑纸饧?xì)胞外基質(zhì)的主要成分-Ⅳ型膠原纖維而倍受矚目。MMPs家族抑制劑(matrix metalloproteinases inhibitor，MMPI)可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞在體外三維基質(zhì)培養(yǎng)體系中的侵襲，臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明MMPI的應(yīng)用可以在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但腫瘤患者的總體生存率卻未見顯著提高，這驅(qū)使人們重新思考腫瘤侵襲的機(jī)制及治療策略

4、。近年來細(xì)胞骨架重構(gòu)在腫瘤細(xì)胞侵襲遷移過程中的作用日益受到重視并逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成，目前與細(xì)胞遷移相關(guān)的研究主要集中于微絲。根據(jù)遷移策略、突破組織屏障的方式及與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用等方面的不同可以將細(xì)胞的運(yùn)動方式分為兩種，即阿米巴樣細(xì)胞運(yùn)動(amoeboid movement)和間充質(zhì)樣細(xì)胞運(yùn)動(mesenchymal movement)，人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤正是間充質(zhì)樣細(xì)胞運(yùn)動的典型。在間充質(zhì)樣細(xì)胞運(yùn)

5、動中，微絲構(gòu)成的與遷移有關(guān)的結(jié)構(gòu)主要有絲狀偽足(filopodia)、板狀偽足(Lamellipodia)及張力纖維(stress fibers)。絲狀偽足是由肌動蛋白纖維平行排列形成的細(xì)小(0.1-0.3μm)指樣突起，可以探測細(xì)胞外信息；板狀偽足是細(xì)胞前緣由肌動蛋白呈網(wǎng)狀排列構(gòu)成的薄片狀(0.1-0.2μm)結(jié)構(gòu)，能提供足夠的支持力以使細(xì)胞膜表面形成突起；張力纖維是細(xì)胞內(nèi)部由反向平行的肌動蛋白纖維及肌球蛋白Ⅱ(myosinⅡ)構(gòu)成的

6、一種可收縮性結(jié)構(gòu)，在粘附結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用下為細(xì)胞收縮提供動力。在間充質(zhì)樣細(xì)胞運(yùn)動過程中，首先由絲狀偽足對細(xì)胞周圍環(huán)境進(jìn)行探測，接著肌動蛋白以板狀偽足為支持物大量聚合將細(xì)胞膜向前頂起，形成細(xì)胞前端突起，隨后細(xì)胞突起與底物之間發(fā)生粘附，進(jìn)而張力纖維收縮拉動細(xì)胞核及細(xì)胞器向前端移動，最后細(xì)胞尾端與底物之間粘附作用解除，細(xì)胞膜也隨之前移，細(xì)胞完成在平板培養(yǎng)體系中的“爬行”。任何影響細(xì)胞外基質(zhì)降解及細(xì)胞變形能力的因素均可影響腫瘤細(xì)胞的侵襲行為。腫瘤

7、微環(huán)境顯著影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放、化療敏感性的改變及增殖、凋亡及侵襲能力的變化。腫瘤微環(huán)境中大量存在的各種細(xì)胞因子及低氧分壓是改變腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的重要始動因素。白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)是一種多功能細(xì)胞因子，參與機(jī)體造血、免疫及炎癥反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在多種腫瘤細(xì)胞如前列腺癌、乳腺癌、肺癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，并參與腫瘤增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)性狀的調(diào)節(jié)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，

8、血清IL-6水平可在一定程度上可以預(yù)測患者的預(yù)后。此外，IL-6基因敲除后的小鼠自發(fā)性膠質(zhì)瘤的發(fā)生率較母系鼠相比明顯下降，以上均提示IL-6在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用。雖然IL-6在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖過程中的作用已經(jīng)早有研究，但是否也影響人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移能力目前還不清楚。低氧(Hypoxia)是直徑大于2mm的腫瘤組織的顯著性特征。雖然膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是人體最富血管的腫瘤之一，但由于腫瘤細(xì)胞生長代謝旺盛及血管結(jié)構(gòu)異常，

9、腫瘤組織仍然高度缺氧并常在腫瘤中心形成壞死區(qū)。低氧可以顯著上調(diào)包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力，但其具體機(jī)制目前仍存在爭議。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種受低氧調(diào)節(jié)的多功能細(xì)胞因子，參與機(jī)體免疫與炎癥反應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)MIF可以增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力。低氧下人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遷移能力上調(diào)是否與MIF表達(dá)上調(diào)相關(guān)及MIF調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲遷移

10、的具體機(jī)制目前尚不清楚。本課題包含部分，分別研究IL-6及低氧對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移能力的影響，并探討其機(jī)制，以期能為人腦膠質(zhì)瘤的抗侵襲治療提供一定的理論依據(jù)。
　　 第一部分：IL-6對人腦膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤侵襲遷移能力的影響及機(jī)制研究。
　　 目的：⑴檢測人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞系中IL-6的表達(dá)情況；⑵研究IL-6對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲及遷移的影響；⑶研究IL-6促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移的分子機(jī)制；⑷研究介導(dǎo)I

11、L-6促人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路；⑸研究IL-6對人腦膠質(zhì)瘤血管生成的影響。
　　 方法：①收集3例人腦膠質(zhì)瘤、1例膠質(zhì)瘤瘤旁組織、1例正常腦組織及1例高血壓腦出血患者的組織標(biāo)本。RT-PCR檢測人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞系中IL-6基因表達(dá)情況。②生長良好的T98G及U251細(xì)胞無血清饑餓6h，收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，分別加不同濃度IL-6刺激。200μl上述細(xì)胞懸液分別加入Tr

12、answell小室上室，下室加入含血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)(T98G20％，U25110％)，培養(yǎng)12h后取出小室，經(jīng)固定、染色后照相，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿過上室基底膜的細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。③生長良好的T98G及U251細(xì)胞無血清饑餓6h，采用含有不同濃度IL-6的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，RT-PCR檢測IL-6對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤MMP2/9基因表達(dá)的影響。④生長良好的T98G及U251細(xì)胞無血清饑餓6h，采用含有不同濃度IL-6的無血清培養(yǎng)

13、基培養(yǎng)20min，Western blot檢測IL-6對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤JAK/STAT3、MAPK/ERK及PI3K/AKT信號通路活化的影響。⑤生長良好的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251更換無血清RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)6小時(shí)后收集上清。⑥收集生長良好的血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304，RT-PCR檢測ECV-304中IL-6及IL-6受體亞基gp80和gp130的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：⑴在所檢測的3例膠質(zhì)瘤及1例膠質(zhì)瘤瘤旁組織標(biāo)本

14、中，均存在IL-6基因表達(dá)，在正常腦組織中未檢測到IL-6基因表達(dá)，在所檢測的1例高血壓腦出血患者減壓組織中也存在IL-6基因表達(dá)。所有被檢測的3種人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G、U87及U251均存在IL-6基因水平表達(dá)。⑵Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)均表明IL-6可以劑量依賴性促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U251的侵襲及遷移，與空白組相比，高濃度IL-6作用下具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，IL-6可以劑

15、量依賴性促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251的非趨化性遷移能力，卻抑制T98G細(xì)胞的非趨化性遷移能力。MTT結(jié)果表明，在本研究中侵襲遷移實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)條件下，T98G細(xì)胞的增殖能力輕度受抑制，而U251細(xì)胞的增殖能力輕度增強(qiáng)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶RT-PCR、Western blot結(jié)果顯示IL-6可上調(diào)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G和U251 MMP9基因及蛋白的表達(dá)水平，而不影響MMP2的表達(dá)水平。明膠酶譜法顯示人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98

16、G及U251上清中存在MMP2酶活性，但不受IL-6影響。在U251細(xì)胞系上清中檢測到MMP9酶活性，且呈現(xiàn)IL-6劑量依賴性；在T98G細(xì)胞上清中，MMP9酶活性不明顯。Western blot及免疫熒光染色結(jié)果顯示IL-6可促進(jìn)T98G及U251細(xì)胞Fascin-1的蛋白表達(dá)水平，并促進(jìn)其向細(xì)胞邊緣分布。細(xì)胞骨架免疫熒光染色結(jié)果顯示IL-6可促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U251板狀偽足的形成。⑷Western blot結(jié)果顯示

17、IL-6刺激后，T98G及U251細(xì)胞JAK/STAT3 Tyr705位磷酸化水平變化不明顯，而Ser727位磷酸化水平升高，且呈現(xiàn)IL-6劑量依賴性。T98G及U251細(xì)胞中均存在高水平的p-AKT，但不受IL-6刺激的影響。IL-6可促進(jìn)U251細(xì)胞p42/44 MAPK的磷酸化水平，而抑制T98G細(xì)胞p42/44 MAPK的磷酸化水平。G-LISA結(jié)果顯示IL-6可明顯促進(jìn)Racl-GTPase活性，而對RhoA、Cdc42活性影

18、響不大。⑸Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤培養(yǎng)上清可明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304的遷移能力，IL-6多克隆抗體可抑制膠質(zhì)瘤上清對ECV-304遷移的促進(jìn)作用。RT-PCR結(jié)果顯示在血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304中存在IL-6及IL-6R的表達(dá)。
　　 結(jié)論：①.膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞系中存在IL-6表達(dá)；②IL-6可促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G及U251的侵襲及遷移；③IL-6促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98

19、G及U251 MMP9的表達(dá)；④IL-6促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G及U251 Fascin-1的表達(dá)并改變其分布；⑤IL-6促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G及U251板狀偽足的形成；⑥JAK/STAT3及Rac1信號介導(dǎo)IL-6對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U251遷移的促進(jìn)作用；⑦IL-6可以以旁分泌方式促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管生成。
　　 第二部分：低氧對人腦膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤侵襲遷移能力的影響及機(jī)制研究。
　　 目的

20、：⑴研究低氧對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移的影響；⑵研究低氧促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移的分子機(jī)制；⑶MIF與低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遷移能力增強(qiáng)的相關(guān)性研究；⑷研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中MIF信號各節(jié)點(diǎn)分子的表達(dá)情況。
　　 方法：①收集生長良好的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87，重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，200μl上述細(xì)胞懸液分別加入Transwell小室上室，下室加入含血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)(T98G20％，U87

21、10％)，分別在第4、8h將一處理組送入低氧培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2、1％O2)，第12h終止實(shí)驗(yàn)，取出各小室，經(jīng)固定染色后照相，隨機(jī)選取S個(gè)視野計(jì)數(shù)穿過上室基底膜的細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。②生長良好的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87，更換無血清培養(yǎng)基，分別在0、4、8h將不同處理組送到低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12h結(jié)束實(shí)驗(yàn)，收集上清，明膠酶譜法檢測不同處理組上清中MMP2/9的活性。③生長良好的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U871×1

22、05/孔接種6孔板，過夜后分別在常氧及低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，RT-PCR及Western blot分別在基因及蛋白水平上檢測低氧培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤MIF表達(dá)水平的變化。④收集生長良好的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87，1×105/孔接種6孔板，過夜后分別在常氧及低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。RT-PCR檢測MIF信號通路中各節(jié)點(diǎn)分子CD74、CD44、Tiam-1、Vav2、p115RhoGEF、RhoA、Rac1及Cdc

23、42的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：⑴與對照組相比，低氧培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87侵襲性增強(qiáng)，而且隨低氧處理時(shí)間的延長穿過小室基底膜到達(dá)下表面的細(xì)胞也增多，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。⑵低氧培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87上清中MMP2及MMP9活性未見明顯變化。⑶光鏡下見低氧環(huán)境下培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤胞體更加細(xì)長，極性增強(qiáng)。細(xì)胞骨架免疫熒光染色見細(xì)胞內(nèi)張力纖維形成明顯增多。⑷G-LISA檢測結(jié)果顯

24、示在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Rac1活性增強(qiáng)，RhoA活性下降，Cdc42活性變化不明顯。⑸RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87中MIF基因及蛋白表達(dá)水平均有明顯升高。⑹Transwell結(jié)果顯示外源性MIF可以明顯增強(qiáng)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87的遷移能力。⑺光鏡下觀察見外源性MIF刺激后T98G與U87細(xì)胞變得更加細(xì)長，細(xì)胞極性增強(qiáng)。細(xì)胞骨架免疫熒光染色

25、結(jié)果顯示外源性MIF可以促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤張力纖維的形成。⑻RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示MIF siRNA s2序列可顯著抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中MIF基因及蛋白表達(dá)水平。⑼Transwell結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染MIF siRNA后人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G和U87在常氧及低氧環(huán)境下遷移能力均明顯下降。⑽細(xì)胞骨架免疫熒光染色結(jié)果顯示MIF干擾后低氧誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤張力纖維形成的作用消失。⑾RT-PCR結(jié)果顯示人腦膠質(zhì)母細(xì)

26、胞瘤細(xì)胞T98G及U87均表達(dá)MIF信號通路中各節(jié)點(diǎn)分子，如CD74、CD44、Tiam-1、Vav2、p115RhoGEF、RhoA、Rac1及Cdc42。
　　 結(jié)論：①低氧培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87侵襲遷移能力明顯增強(qiáng)；②低氧培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87上清中MMP2/9活性變化不明顯；③低氧培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G及U87細(xì)胞骨架發(fā)生重排，細(xì)胞更加細(xì)長，富有極性，細(xì)胞內(nèi)張力纖維形成