Let-7f和MMPI對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。膠質(zhì)瘤患者的生存期比較短，大約為14個月。盡管近年來，膠質(zhì)瘤手術技術、化療、放療等治療手段，取得了很大進步，然而，膠質(zhì)瘤確診患者中，只有大約5％的患者生存期超過5年。膠質(zhì)瘤的惡性行為主要是由于其快速的生長、血管形成、全腦廣泛的浸潤侵襲及多種化療藥物的耐藥等。如何能有效的抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和侵襲的能力，并且延長患者的生存時間和改善患者的生存狀態(tài)是當今神經(jīng)科學亟待解決的問題。然而，理解引起膠質(zhì)瘤惡

2、性行為的生物學作用和分子機制是目前首要解決的問題。
　　MicroRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄或降解靶點mRNA來抑制蛋白的轉(zhuǎn)錄。大量的報道顯示，在腫瘤細胞中，microRNA起到致癌基因或抑癌基因作用。MicroRNA在腫瘤細胞的分化、生長和細胞運動中扮演重要角色。相比較在正常腦組織中，在膠質(zhì)瘤細胞中有大量的microRNAS異常表達，并參與到膠質(zhì)瘤細胞的起源和發(fā)展。Let-7f是Let-7家族成員，位于9q22.3。Let-7f在不同的

3、腫瘤中表達是不同的，在許多腫瘤中表達下調(diào)，包括卵巢癌、肉瘤、胃癌等。然而，Let-7f在乳腺癌和肝癌中的表達是上調(diào)的。Let-7f主要的生物學功能是參與到腫瘤細胞的起源和進展。目前，有報道顯示Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞中表達下調(diào)。然而，Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞的生物學作用及機制并不十分清楚。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在膠質(zhì)瘤細胞的運動過程中發(fā)揮重要的作用，因此，MMPs被認為是膠質(zhì)瘤治療的重要靶點之一。然而，不幸的是，基質(zhì)金屬

4、蛋白酶抑制劑(MMPI)對膠質(zhì)瘤患者治療的結(jié)果并不令人滿意，沒有取得顯著的治療效果。因此，研究MMPI失敗的原因是必要的。腫瘤細胞具有可塑性，在不同的環(huán)境中能夠采取間充質(zhì)樣或阿米巴樣這兩種不同方式來運動。一些腫瘤細胞采取間充質(zhì)-阿米巴運動模式的轉(zhuǎn)換(MAT)來補償MMPI對腫瘤細胞侵襲的抑制作用，并且MAT是MMPI治療腫瘤失敗的重要原因和機制。然而，在膠質(zhì)瘤在膠質(zhì)瘤治療中，很少報告MMPI是否能夠引起膠質(zhì)瘤（間充質(zhì)-阿米巴轉(zhuǎn)換）(MA

5、T)。更重要的是本研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號在MAT過程中起關鍵作用，聯(lián)合應用MMPI和RhoA/ROCK通路抑制劑，能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細胞的運動能力。
　　本課題分兩部分:分別研究了Let-7f和MMPI對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響，并探討其機制，以期為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論基礎和實踐依據(jù)。
　　第一部分: Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究
　　1.膠質(zhì)瘤組織和細胞系Let-7f的

6、表達下調(diào)
　　首先，我們分別檢測了膠質(zhì)瘤組織樣本、正常腦組織和膠質(zhì)瘤細胞系中Let-7f的表達情況。結(jié)果顯示，Let-7f在膠質(zhì)瘤組織樣本中比正常腦組織中表達下調(diào)，其表達情況與膠質(zhì)瘤級別的增高呈負相關。同樣，Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系T98G、U87和A172比在正常星型細胞系表達下調(diào)。另外，我們統(tǒng)計分析了在膠質(zhì)母細胞瘤中Let-7f表達與患者生存期的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的低生存期伴隨著Let-7f的低表達。這些結(jié)果暗示了Let-7

7、f在膠質(zhì)瘤細胞中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　2.在體外膠質(zhì)瘤細胞中過表達Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力
　　U87和A172細胞轉(zhuǎn)染后，采用CCK-8法檢測，分別在24、48、72和96小時，檢測膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力。結(jié)果顯示:膠質(zhì)瘤細胞Let-7f過表達組比未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組細胞的增殖能力下降;Edu檢測實驗也表明了過表達Let-7f顯著的抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖能力。另外，克隆形成實驗的結(jié)果顯示:Let-7f過表達組

8、的克隆數(shù)目比未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組明顯減少，這說明過表達Let-7f能夠長時抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長能力。這些實驗結(jié)果表明了在體外過表達Let-7f能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞生長能力。
　　3.在體外膠質(zhì)瘤細胞中過表達Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲
　　Transwell侵襲和遷移實驗檢測Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞運動能力的影響，結(jié)果顯示:膠質(zhì)瘤細胞在轉(zhuǎn)染48小時后，Let-7f過表達組細胞的侵襲和遷移能力比空白組和陰性對照組明顯降低

9、。MMP2和MMP9蛋白水平降低。這些結(jié)果表明了，在體外膠質(zhì)瘤細胞中過表達Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的能力。
　　4.Periostin是Let-7f的直接靶點
　　我們查閱Microrna、Targetscan和miRBase等數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)periostin與Let-7f在3'UTR區(qū)具有潛在的結(jié)合位點。熒光素酶報告基因法和western blot檢測的結(jié)果進一步驗證了periostin為Let-7f直接靶點基因

10、。
　　5.Periostin涉及到Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲和遷移的調(diào)節(jié)。
　　我們選用干擾RNA方法敲除periostin，進一步檢測periostin敲除后，對細胞行為的影響，發(fā)現(xiàn)periostin敲除后，細胞侵襲、遷移和增殖能力下降。膠質(zhì)瘤細胞過表達periostin能夠部分逆轉(zhuǎn)Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用。
　　6.在體內(nèi)，Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞惡性表現(xiàn)
　　在膠質(zhì)瘤皮下異位模型中瘤內(nèi)

11、注射Let-7f，結(jié)果顯示:Let-7f處理組中腫瘤的體積和重量比空白對照和陰性對照組明顯減小。顱內(nèi)模型顯示了:Let-7f處理組中，腫瘤組織與正常組織的邊緣是清晰的。這些結(jié)果表明在體內(nèi)，Let-7f能夠抑制膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)Let-7f在膠質(zhì)瘤低表達，過表達Let-7f能夠在體內(nèi)外抑制膠質(zhì)瘤增殖、侵襲及遷移的能力，periostin為Let-7f靶點基因，并進一步表明了Let-7f有希望成為膠質(zhì)瘤診斷和治

12、療的新靶點。
　　第二部分:MMPI對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究
　　1.MMPI(ILO)對膠質(zhì)瘤細胞活力和侵襲能力的影響
　　采用不同濃度的MMPI(0-100μM)處理膠質(zhì)瘤細胞24小時，CCK-8檢測的結(jié)果:0-50μM沒有對膠質(zhì)瘤有明顯的影響，當藥物濃度大于75μM時明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的活性。我們選用MMPI(50μM)作為后續(xù)實驗的使用濃度。MMPI(50μM)處理膠質(zhì)瘤細胞24小時，膠質(zhì)瘤

13、細胞仍能保持較高的侵襲遷移能力。
　　2.MMPI(ILO)誘導膠質(zhì)瘤細胞采用阿米巴樣運動方式
　　為了研究MMPI對細胞運動方式的影響，我們進一步檢測ILO對膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)和骨架的影響。結(jié)果顯示，MMPI誘導膠質(zhì)瘤細胞由長梭形轉(zhuǎn)變成圓形，細胞骨架有縱行排列轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀排列。同時，MMPI誘導RhoA/ROCK/MLC信號活化。
　　3.RhoA/ROCK介導了MMPI(ILO)誘導膠質(zhì)瘤細胞阿米巴樣轉(zhuǎn)變
　　我們

14、選用了RhoA/ROCK通路抑制劑Y-27632處理細胞，結(jié)果顯示:Y-27632處理后，由ILO誘導形成的圓形細胞比例下降，并且膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力進一步下降。
　　4.P115RhoGEF參與了MMPI(ILO)誘導的RhoA的活化，
　　為了進一步探究RhoA的活化機制，我們檢測P115RhoGEF是否參與了MMPI(ILO)誘導的RhoA活化，結(jié)果顯示:MMPI能夠誘導膠質(zhì)瘤細胞P115RhoGEF的活化，P115R

15、hoGEF-siRNA后，RhoA活性降低，MMPI誘導的圓形細胞比例下降和阿米巴樣侵襲遷移能力下降。
　　5.在體內(nèi)聯(lián)合應用MMPI(ILO)和ROCKI能夠延長了荷瘤裸鼠的生存時間
　　我們構(gòu)建膠質(zhì)瘤細胞原位模型，腹腔注射MMPI和ROCKI結(jié)果顯示:聯(lián)合應用MMPI和ROCKI比單獨應用MMPI或ROCKI裸鼠的生存時間明顯延長。
　　總之，MMPI(ILO)誘導膠質(zhì)瘤細胞活化P115RhoGEF/RhoA/RO