急性淋巴細(xì)胞白血病糖皮質(zhì)激素抵抗機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分、急性淋巴細(xì)胞白血病糖皮質(zhì)激素抵抗與糖皮質(zhì)激素受體亞型表達(dá)的研究
　　目的:通過檢測(cè)急性T淋巴細(xì)胞白血病糖皮質(zhì)激素(GC)耐藥(CCRF-CEM-C1)和敏感(CCRF-CEM-C7)細(xì)胞株在與地塞米松共培養(yǎng)過程中糖皮質(zhì)激素受體(GR)各亞型(GRα、GRβ、GRγ、GR-P)的表達(dá)變化和成人急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者在不同病期及不同臨床預(yù)后中的GR各亞型(GRα、GRβ、GRγ、GR-P)的表達(dá)，探討GR各亞型表達(dá)

2、變化在ALLGC抵抗中的作用及與臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:
　　1、選取GC耐藥(CCRF-CEM-C1)和敏感細(xì)胞株(CCRF-CEM-C7)培養(yǎng)待檢測(cè)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，驗(yàn)證C1和C7細(xì)胞對(duì)GC敏感性差異，并探尋最佳GC實(shí)驗(yàn)濃度。流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞與GC共培養(yǎng)過程中的凋亡，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)GR各亞型的表達(dá)，探尋GR各亞型表達(dá)及GR自誘導(dǎo)在GC抵抗中的作用。
　　2、收集我院住院ALL病人

3、64例，其中B-ALL54例，T-ALL10例，男性31例，女性33例，初治20例，復(fù)發(fā)26例，完全緩解18例。參照NCCN2012ALL診治指南，將ALL患者分為預(yù)后良好組30例，預(yù)后不良組34例。另取缺鐵性貧血患者20例（男性9例，女性11例）為對(duì)照組。抽取ALL和對(duì)照組患者骨髓液，分出單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)成人ALL患者在不同病期及不同分組中的GR各亞型(GRα、GRβ、GRγ、GR-P)表達(dá)情

4、況，分析GR各亞型表達(dá)與ALL病期、臨床療效及諸多臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，探尋成人ALL GR各亞型表達(dá)與GC抵抗的關(guān)系。同樣方法檢測(cè)對(duì)照組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的GR各亞型(GRα、GRβ、GRγ、GR-P)表達(dá)情況，分析對(duì)照組和成人ALL患者GR各亞型表達(dá)的差異。
　　結(jié)果:
　　1、通過MTT實(shí)驗(yàn)證明C1和C7細(xì)胞對(duì)GC敏感性不同，C7細(xì)胞對(duì)地塞米松(DEX)的敏感性明顯高于C1細(xì)胞，二者與10-7mol/L的地塞米松共培養(yǎng)時(shí)

5、差異最顯著。
　　2、兩組細(xì)胞與DEX共培養(yǎng)時(shí)，C7組細(xì)胞隨著時(shí)間變化凋亡明顯高于C1組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、兩組細(xì)胞與DEX共培養(yǎng)時(shí)，隨著時(shí)間變化GR各亞型表達(dá)趨勢(shì)不同，C1組細(xì)胞GR各亞型變化不明顯，而C7組GRα GRβ GRγ均為先升后降趨勢(shì)，GRαmRNA表達(dá)在48h達(dá)最高點(diǎn)(72.49±3.65)，GRβ mRNA、GRγ mRNA高峰前移，在24h達(dá)最高點(diǎn)(分別為0.02±0.01和5.24±0.0

6、5)，而GR-PmRNA則呈持續(xù)上升趨勢(shì)(72h為12.61±0.63)。兩組細(xì)胞GR各亞型表達(dá)均為GRα最高，GRβ最低，C1組細(xì)胞在24h內(nèi)GRγ mRNA表達(dá)略高于GR-PmRNA，此后隨著時(shí)間變化GR-PmRNA逐漸高于GRγ mRNA。而C7組細(xì)胞始終GR-PmRNA高于GRγ mRNA。對(duì)比兩組細(xì)胞在與DEX共培養(yǎng)過程中，GRα/GRγ mRNA比值變化趨勢(shì)不同，C7組在48h時(shí)明顯高于C1組;GRα/GR-PmRNA比值兩

7、組變化趨勢(shì)不同，C7組在24h時(shí)明顯低于C1組;GRγ/GR-PmRNA比值在C1與C7兩組間變化趨勢(shì)相接近，C1組在24h明顯高于C7組。在0h時(shí)C1組總GR值(12.62)高于C7組(4.24)，但隨著時(shí)間變化C7組逐漸升高且明顯高于C1組，C1組則升高不明顯。
　　4、20例對(duì)照和64例成人ALL患者GR各亞型mRNA表達(dá)所占比例均為GRα＞GR-P＞GRγ＞GRβ;兩組間各亞型表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、依據(jù)AL

8、L病期（初治，復(fù)發(fā)和完全緩解CR）分組，GRγmRNA表達(dá)在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值0.000，余GRα、GR-P、GRβ各亞型表達(dá)在各組間無明顯差別;進(jìn)一步行組間分析發(fā)現(xiàn)CR組GRγmRNA表達(dá)（P50值15.82）明顯高于復(fù)發(fā)組（P50值8.21）高于初治組（P50值1.93），P值均低于校正P值0.016。
　　6、ALL患者中復(fù)發(fā)組總GR中位值(70.69)高于緩解組總GR中位值(48.01)高于初治組總GR中位值(3

9、4.75)。各組GR各亞型比例如下:初治組與復(fù)發(fā)組均為GRα mRNA＞GR-PmRNA＞GRγ mRNA＞GRβ mRNA，而CR組則為GRα mRNA＞GRγ mRNA＞GR-PmRNA＞GRβmRNA。GRαmRNA占總GR比值在初治組中明顯高于復(fù)發(fā)組高于CR組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GRγmRNA占總GR比值則與GRα mRNA相反，在初治組中明顯低于復(fù)發(fā)組低于CR組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GRβ mRNA占總GR比值在各組間差異無

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析GR各亞型之間比值發(fā)現(xiàn)GRα/GRβ比值在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而GRα/GRγ比值在初治組高于復(fù)發(fā)組高于CR組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GRα/GR-P比值初治組高于復(fù)發(fā)組和CR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 GRγ/GR-P比值在CR組高于初治和復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7、分析ALL亞型對(duì)GR表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)T-ALL總GR中位值(73.16)高于B-ALL組(42.65)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組各亞型表

11、達(dá)比例均為GRα mRNA＞GR-PmRNA＞GRγ mRNA＞GRβ mRNA，T-ALL組GR各亞型表達(dá)除GRβmRNA外均高于B-ALL組，尤其GR-PmRNA表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組間GR各亞型表達(dá)占總GR比值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，GRα/GRβ比值、GRα/GRγ比值、GRα/GR-P比值及GRγ/GR-P比值在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　8、預(yù)后不良組中總GR中位值45.13與預(yù)后良好組總GR中位值44.83接近，各亞型表達(dá)

12、比例均為GRα mRNA＞GR-PmRNA＞GRγ mRNA＞GRβ mRNA，兩組總GR值及各亞型比例及GRα/GRβ比值、GRα/GRγ比值、GRα/GR-P比值及GRγ/GR-P比值相接近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　9、ALL患者GRα mRNA、GR-PmRNA、GRγ mRNA之間呈正相關(guān)，尤其GRα與GR-P相關(guān)系數(shù)最強(qiáng)(r=0.916，P=0.000);外周血HB值與GRα與GR-P值呈正相關(guān)(P＜0.05)，而外周血WB

13、C數(shù)與GRγ呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，余GR各亞型表達(dá)與血脂各值、與LDH、β2MG、患者年齡、外周血血小板數(shù)及骨髓中幼稚細(xì)胞數(shù)無相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1、C1、C7組細(xì)胞對(duì)GC敏感性不同，可用于研究ALLGC抵抗機(jī)制。
　　2、基線水平的GR值對(duì)GC敏感與否意義有限，GR自誘導(dǎo)作用在GC敏感性中有一定作用;GC應(yīng)用后GR各亞型表達(dá)變化與GC抵抗有關(guān)。
　　3、GRα mRNA在ALLGC抵抗中起主導(dǎo)作用，

14、GRβ mRNA對(duì)GC抵抗意義不大。GR-PmRNA和GRγ mRNA兩亞型表達(dá)變化可能參與ALLGC抵抗。
　　4、GR各亞型表達(dá)與ALL病期相關(guān)，GRα的降低，GRγ的升高與ALL緩解相關(guān)，可能有助于預(yù)測(cè)GC療效?？侴R值和各亞型的變化與ALL分型相關(guān)。
　　5、ALL患者GRα mRNA、GR-PmRNA及GRγ mRNA之間呈正相關(guān);外周血HB及WBC可能參與調(diào)節(jié)GR亞型的表達(dá)。
　　第二部分、急性淋巴細(xì)胞白血

15、病BCL-2、BAX和 GILZ表達(dá)與GC抵抗關(guān)系
　　目的:檢測(cè)急性T淋巴細(xì)胞白血病糖皮質(zhì)激素(GC)耐藥和敏感細(xì)胞株在與地塞米松共培養(yǎng)過程中BCL-2、BAX和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)的表達(dá)和成人急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者在不同病期及不同臨床預(yù)后中的GILZ的表達(dá)，探討上述因素與ALLGC抵抗的關(guān)系。
　　方法:GC耐藥和敏感細(xì)胞株(CCRF-CEM-C1和CCRF-CEM-C7)培養(yǎng)待檢測(cè)。收集

16、我院住院ALL病人64例，其中B-ALL54例，T-ALL10例，男性31例，女性33例，初治20例，復(fù)發(fā)26例，完全緩解18例。參照NCCN2012ALL診治指南，將ALL患者分為預(yù)后良好組30例，預(yù)后不良組34例。另取缺鐵性貧血患者20例（男性9例，女性11例）為對(duì)照組。
　　1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩株細(xì)胞與GC共培養(yǎng)過程中不同時(shí)間點(diǎn)BCL-2、BAX和GILZ的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的GILZmRN

17、A的表達(dá)，探尋上述因素在GC抵抗中的作用。
　　2、抽取骨髓液，采用FiColl密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)成人ALL患者在不同病期及不同分組中的GILZmRNA表達(dá)，分析其與ALL病期、臨床療效及諸多臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，探尋其與成人ALL GC抵抗的關(guān)系。
　　3、同樣方法檢測(cè)對(duì)照組患者的GILZmRNA表達(dá)情況，分析對(duì)照組和成人ALL患者GILZmRNA表達(dá)的差異。

18、>　　結(jié)果:
　　1、C1、C7組細(xì)胞在與DEX共培養(yǎng)過程中，C1組細(xì)胞BCL-2表達(dá)無明顯變化，C7組細(xì)胞BCL-2蛋白表達(dá)逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、C1、C7組細(xì)胞BAX表達(dá)隨時(shí)間無明顯變化，但C7組BAX表達(dá)較C1組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、C1、C7兩組細(xì)胞GILZmRNA及蛋白表達(dá)均隨著時(shí)間而增高，變化趨勢(shì)相同，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、在ALL患者中，對(duì)照組的GILZm

19、RNA(P50值526.63)明顯高于ALL患者(P50值36.44)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。緩解組GILZmRNA(P50值45.51)略高于初治組(39.55)高于復(fù)發(fā)組(28.97)，但ALL患者各病期之間GILZmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T-ALL的GILZmRNA(P50值46.28)表達(dá)高于B-ALL(P50值36.15)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.預(yù)后良好組GILZmRNA(P50值37.37)表達(dá)略高于預(yù)后不良組(P50值36

20、.15)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GILZmRNA表達(dá)與GRα mRNA，GRγ mRNA，GR-PmRNA之間呈正相關(guān)?；颊逩ILZmRNA表達(dá)與血脂、LDH、年齡、外周血WBC、HB、PLT值及骨髓中白血病細(xì)胞數(shù)之間無相關(guān)關(guān)系，與血β2MG表達(dá)有一定的正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值0.064。
　　結(jié)論:
　　1、GC可通過誘導(dǎo)BCL-2表達(dá)下調(diào)來誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，此可能為GC誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞腫瘤凋亡的機(jī)制之一。
　　2

21、、BAX高表達(dá)可能與ALLGC敏感有關(guān)。
　　3、在C1，C7細(xì)胞株中GILZmRNA和蛋白均可被地塞米松誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，但與GC抵抗無明顯相關(guān)性。
　　4、GILZmRNA可能參與GR各亞型表達(dá)的調(diào)控。
　　第三部分、急性淋巴細(xì)胞白血病耐藥及敏感細(xì)胞株在GC誘導(dǎo)過程中P170表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)地塞米松藥物濃度的研究
　　目的:通過對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血病糖皮質(zhì)激素(GC)耐藥和敏感細(xì)胞株在與地塞米松共培養(yǎng)過程中P170表

22、達(dá)和細(xì)胞內(nèi)地塞米松藥物濃度的檢測(cè)，探討多藥耐藥在GC抵抗中的作用。
　　方法:選取GC耐藥和敏感細(xì)胞株（CCRF-CEM-C1和CCRF-CEM-C7）培養(yǎng)待檢測(cè)。
　　1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞與GC共培養(yǎng)過程中不同時(shí)間點(diǎn)P170蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與GC抵抗關(guān)系。
　　2、采用反相高效液相色譜分析法檢測(cè)兩組細(xì)胞與地塞米松共培養(yǎng)過程中不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)地塞米松濃度，分析細(xì)胞內(nèi)藥物濃度與GC抵抗關(guān)系。
　　3、

23、綜合分析上述兩個(gè)指標(biāo)變化，探討多藥耐藥在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)GC抵抗中的作用。
　　結(jié)果:
　　1、C1、C7兩組細(xì)胞與10-7mol/L地塞米松共培養(yǎng)后，P170蛋白的表達(dá)隨時(shí)間變化表現(xiàn)為先升后降趨勢(shì)，C1組細(xì)胞P170蛋白表達(dá)略高于C7組細(xì)胞，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)地塞米松濃度，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞內(nèi)地塞米松藥物濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)無明顯變化，雖然C7組細(xì)胞內(nèi)地塞米松濃度略高于C1組細(xì)胞，但差異無統(tǒng)