核肌球蛋白在Nox2介導(dǎo)的心肌缺血性損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一章 Nox2/VPO1途徑在心肌缺血/再灌注氧化損傷中的作用及機(jī)制
　　研究背景：
　　心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，IR）損傷是缺血心肌恢復(fù)血液灌流后損傷進(jìn)一步加劇的現(xiàn)象。
　　心肌IR損傷涉及多種機(jī)制，氧化應(yīng)激是其中之一。氧化應(yīng)激損傷由活性氧(reactive oxidative species，ROS)過量所致。缺血心肌中ROS主要來源于NADPH氧化酶(NADPH oxidas

2、e，Nox)。心肌細(xì)胞主要表達(dá)Nox2和Nox4兩種亞型，Nox可以催化氧分子得電子生成超氧陰離子。超氧陰離子極不穩(wěn)定，介導(dǎo)氧化損傷作用有限，而且很快轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2在過氧化物酶催化下生成氧化活性更強的HOCl，引起心肌細(xì)胞損傷（包括細(xì)胞凋亡）。
　　血管過氧化物酶(vascular peroxidase，VPO)為新發(fā)現(xiàn)的過氧化物酶家族成員，能催化H2O2生成氧化活性更強的HOCl，心臟中主要表達(dá)VPO1。我們推測Nox

3、2和VPO1可能以H2O2為中介形成Nox/VPO1途徑參與介導(dǎo)IR氧化應(yīng)激損傷。為此，我們采用了大鼠IR和心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，HR)模型探討該途徑在IR損傷中的作用及機(jī)制，該研究將豐富心肌IR損傷的氧化應(yīng)激學(xué)說，也為抗心肌IR的治療和新藥的開發(fā)提供新思路。
　　方法：
　　我們首先采用大鼠心肌IR模型，結(jié)合Nox抑制劑(apocynin、DPI)探討了Nox2在心肌IR中的作用以

4、及Nox2與VPO1的相關(guān)性。然后，利用H9c2心肌細(xì)胞HR模型，結(jié)合藥物干預(yù)和基因沉默技術(shù)，進(jìn)一步確定了Nox/VPO1途徑在IR中的作用和機(jī)制。
　　TTC法檢測大鼠心肌梗死面積;比色法檢測血漿CK活性、caspase-3、Nox活性和H2O2水平;心臟HE染色檢查心肌病理結(jié)構(gòu)的改變;TUNEL、hochest染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)法檢測心肌caspase-3表達(dá);免疫熒光雙標(biāo)定位Nox2、VPO1的表達(dá);rea

5、l time PCR檢測心肌Nox2、Nox4、VPO1 mRNA表達(dá)水平;Westernblot檢測Nox2、VPO1、p-JNK、p-p38蛋白表達(dá)水平;熒光探針法檢測心肌細(xì)胞HOCl水平。
　　結(jié)果：
　　IR導(dǎo)致心肌梗死面積增大、血清CK活性升高、心肌細(xì)胞凋亡增加，apocynin或DPI干預(yù)均能抑制心肌IR損傷; IR能上調(diào)心肌Nox2、VPO1表達(dá)，升高Nox活性和血漿H2O2水平，Nox4表達(dá)無明顯變化，apo

6、cynin或DPI干預(yù)均能抑制VPO1表達(dá)、Nox活性和血漿H2O2水平升高，DPI還能抑制Nox2表達(dá)上調(diào)，但apocynin無此作用;apocynin干預(yù)、Nox2或VPO1基因沉默或二者共沉默均能抑制心肌細(xì)胞HR損傷;HR能上調(diào)心肌細(xì)胞Nox2、VPO1表達(dá)，升高Nox活性、HOCl和H2O2水平，apocynin干預(yù)、Nox2或VPO1基因沉默或二者共沉默均能抑制VPO1表達(dá)增加和HOCl水平升高，Nox2基因沉默和Nox2、V

7、PO1雙基因沉默均能明顯抑制心肌細(xì)胞Nox2表達(dá)、Nox活性和H2O2生成，但單獨沉默VPO1基因?qū)ox2表達(dá)、活性及H2O2生成無影響;SOD抑制劑干預(yù)對HR引起的H2O2水平升高無明顯效應(yīng);H2O2能濃度依賴性誘導(dǎo)VPO1表達(dá)，JNK或p38 MAPK干預(yù)能抑制H2O2上調(diào)VPO1表達(dá)的作用。
　　結(jié)論：
　　心肌缺血/再灌注時，Nox2與VPO1以H2O2為中介形成Nox2/VPO1途徑，二者通過協(xié)同作用，共同參與心

8、肌缺血/再灌注氧化損傷。
　　第二章核肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈對Nox2的表達(dá)調(diào)節(jié)及機(jī)制
　　研究背景：
　　心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，IR)時Nox2、VPO1表達(dá)增加，Nox2與VPO1以H2O2為中介形成Nox2/VPO1途徑，參與介導(dǎo)心肌IR氧化損傷。Nox2來源的H2O2經(jīng)由JNK/p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)VPO1表達(dá)，后者在心肌IR損傷中起重要作用。然而，Nox2作為VPO1作

9、用上游其表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚未闡明。
　　肌球蛋白是一種細(xì)胞骨架和肌肉收縮相關(guān)分子，由重鏈、必需輕鏈和調(diào)節(jié)輕鏈(myosin regulatory light chain，MLC20)組成。肌球蛋白除參與肌肉收縮以外，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、粘附和血管內(nèi)皮的通透性等。新近文獻(xiàn)報道，存在于人腸道平滑肌細(xì)胞核內(nèi)的MLC20也能與RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNA polⅡ）、轉(zhuǎn)錄因子ⅡB(transcription fa

10、ctorⅡB，TFⅡB)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，參與結(jié)腸環(huán)狀平滑肌細(xì)胞ICAM-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，此過程涉及MLC20磷酸/去磷酸化。肌球蛋白是否也存在于心肌細(xì)胞核內(nèi)？肌球蛋白除了參與心肌收縮外是否還具有其他功能？Nox2在心肌IR損傷中起重要作用，心肌細(xì)胞核肌球蛋白是否調(diào)節(jié)Nox2表達(dá)？通過生物信息學(xué)預(yù)測， Nox2基因啟動子上游區(qū)域存在MLC20結(jié)合位點。因此，我們于在體心肌IR動物和離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reox

11、ygenation，HR)模型探討核肌球蛋白在心肌IR損傷中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　我們首先采用大鼠心肌IR模型，結(jié)合MLCK抑制劑(ML-7)干預(yù)手段，，探討了MLC20在心肌IR損傷中的作用以及與Nox2之間的聯(lián)系;然后，利用H9c2心肌細(xì)胞HR模型，結(jié)合藥物干預(yù)、基因沉默、免疫共沉淀和染色質(zhì)共沉淀等技術(shù)確定了MLC20對Nox2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　TTC法檢測大鼠心肌梗死面積;比色法檢測血漿CK活性、c

12、aspase-3、Nox活性和H2O2水平;心臟HE染色檢查心肌病理結(jié)構(gòu)的改變;TUNEL、hochest染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)法檢測心肌caspase-3表達(dá);細(xì)胞免疫熒光檢測心肌細(xì)胞MLC20的定位、分布;real time PCR檢測心肌Nox2 mRNA表達(dá)水平;Western blot檢測Nox2、胞漿、胞核MLC20蛋白和磷酸化水平;免疫共沉淀檢測MLC20與RNA polⅡ、TFⅡB的結(jié)合;染色質(zhì)免疫共沉淀檢

13、測MLC20與Nox2基因啟動子上游靶序列的結(jié)合。
　　結(jié)果：
　　IR能導(dǎo)致心肌梗死面積增大、血清CK活性升高、心肌細(xì)胞凋亡增加，ML-7干預(yù)能減輕心肌IR損傷;IR組Nox2表達(dá)、H2O2水平和胞核p-MLC20水平明顯升高，胞漿、胞核MLC20水平無變化，ML-7干預(yù)能顯著降低IR誘導(dǎo)的Nox2表達(dá)、升高H2O2水平和胞核p-MLC20水平，而胞漿、胞核MLC20水平無變化;HR能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡增加，應(yīng)用ML-7或沉

14、默MLC20基因能減少心肌細(xì)胞凋亡;HR組Nox2表達(dá)、胞核p-MLC20和H2O2水平均明顯升高，胞漿、胞核MLC20水平無變化，應(yīng)用ML-7或沉默MLC20基因能顯著降低HR誘導(dǎo)的Nox2表達(dá)、升高H2O2和胞核p-MLC20水平，MLC20基因沉默能降低胞漿、胞核MLC20水平;免疫共沉淀結(jié)果顯示p-MLC20能與RNA polⅡ、TFⅡB結(jié)合;染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示HR能誘導(dǎo)核p-MLC20結(jié)合Nox2基因啟動子上游-289～