microRNA在胃癌器官特異性轉(zhuǎn)移中的作用及機制研究.pdf

1、【背景】
　　胃癌是我國乃至亞洲死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一。肝臟和腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的主要方式，也是導致胃癌治療失敗和患者死亡的重要原因。隨著分子生物學的發(fā)展及雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)及基因芯片等研究方法的廣泛應用，越來越多腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標志物被發(fā)現(xiàn)，但是決定胃癌發(fā)生器官特異性轉(zhuǎn)移的分子機制仍不明確，現(xiàn)有的腫瘤分子標記物和方法學不能區(qū)別腫瘤細胞是否具有轉(zhuǎn)移潛質(zhì)，因此尋找胃癌肝臟/腹膜轉(zhuǎn)移的特異性分子標志物有助于更有效的診斷、治療進展

2、期胃癌。為了探討胃癌器官特異性轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制，我實驗室前期采用國際通用的篩選方法,在裸鼠體內(nèi)應用人類胃癌GC-9811細胞建立了胃癌肝臟/腹膜特異性轉(zhuǎn)移的細胞模型。
　　微小RNA(microRNA)是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)、長度22nt左右的內(nèi)源性非編碼RNA，其編碼基因占到人類總編碼基因的1％，是最大的一類調(diào)控分子。miRNA通過直接降解靶mRNA或者抑制蛋白質(zhì)翻譯來負性調(diào)控靶基因的表達，目前已知人體內(nèi)存在的miRNA分

3、子有800多個，足以調(diào)控人體內(nèi)超過1/3的蛋白編碼基因的表達。miRNA已被證實廣泛參與包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種生理病理過程。但應用MicroRNA技術(shù)研究胃癌的轉(zhuǎn)移特別是胃癌器官特異性轉(zhuǎn)移的分子機制，國內(nèi)外還少有相關(guān)報道。
　　【目的】
　　探討miRNA在胃癌器官特異性轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機制，以期更全面的闡明胃癌轉(zhuǎn)移的機制，并為尋找新的進展期胃癌治療靶點提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.通過

4、miRNA芯片檢測胃癌肝臟/腹膜特異性轉(zhuǎn)移細胞系GC9811-P及其親本細胞GC9811的miRNA表達譜，找出差異表達的miRNA分子；2.收集胃癌轉(zhuǎn)移臨床標本，利用實時熒光定量PCR法對miRNA芯片結(jié)果進行驗證；3.將miR-106b的特異性寡核苷酸前體瞬時轉(zhuǎn)染入胃癌細胞SGC7901、AGS中，上調(diào)該miRNA分子的表達；4.通過細胞劃痕試驗驗證miR-106b對胃癌細胞SGC7901、AGS體外遷移能力的影響；5.通過Tran

5、swell試驗觀察miR-106b對SGC7901、AGS細胞體外侵襲能力的影響；6.利用生物信息學網(wǎng)站和靶基因預測軟件尋找miR-106b可能調(diào)控的靶基因；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸蜻x靶基因進行驗證；7.用Westernblot、RT-PCR明確miR-106b對其靶基因TIMP2的調(diào)控作用及兩者在胃癌細胞及臨床胃癌組織中的表達相關(guān)性；8.通過裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗分析miR-106b對胃癌細胞SGC7901器官特異性轉(zhuǎn)移的影響。
　

6、　【結(jié)果】
　　1.芯片篩選得到71個miRNA分子在胃癌高轉(zhuǎn)移潛能細胞系GC9811-P和其親本細胞GC9811中差異表達（＞2倍）：在GC9811-P細胞中表達升高的miRNAs共44個，包括let-7b,miR-15b,miR-93,miR-106b,miR-107,miR-130和miR-342-3p等；表達降低的miRNAs有27個，包括let-7i,miR-135a*和miR-140-3p等。其與胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系大多數(shù)未

7、見報道；2.Realtime-PCR結(jié)果顯示：miR-106b在10例人類胃癌轉(zhuǎn)移組織中的表達較原發(fā)癌顯著增高，與芯片結(jié)果一致；3.體外細胞劃痕實驗表明，上調(diào)miR-106b的表達，SGC7901及AGS細胞的體外遷移能力顯著增加；4.Transwell實驗同樣證實，上調(diào)miR-106b的表達可顯著增強SGC7901及AGS細胞體外侵襲能力；5.生物信息學預測的眾多miR-106b可能的靶基因中，包括尚未見報道的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因TIMP2，

8、報告基因?qū)嶒炞C實其為miR-106b的靶基因；6.與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-106b特異前體的SGC7901及AGS細胞的TIMP2蛋白水平明顯降低，而mRNA水平則無顯著差異。TIMP2在組織中的表達與miR-106b負相關(guān)；7.裸鼠體內(nèi)實驗表明，人工合成的miR-106b擬似物（mimics）可以增強胃癌細胞SGC7901的肝臟特異性轉(zhuǎn)移能力。
　　【結(jié)論】
　　1.miRNA分子在胃癌肝臟/腹膜特異性轉(zhuǎn)移細胞和其親本