肌肉特異性蛋白MG53在骨髓肌缺血缺氧損傷中的作用機制.pdf

1、目的
　　急性肢體缺血是血管外科最常見的疾病之一，其致殘率和死亡率高，主要原因是由于手術(shù)中長時間的動脈夾閉、急性動脈血栓形成、動脈栓塞、創(chuàng)傷及血管損傷等，該病起病急劇，疼痛劇烈，且多在活動中突然發(fā)生，一旦肢體供血的主動脈突然中斷，使遠端肢體處于缺血缺氧狀態(tài)，如持續(xù)發(fā)展會導(dǎo)致組織細胞功能失調(diào)甚至死亡。因此，早期明確診斷和治療對于血管外科醫(yī)生是一個極大的挑戰(zhàn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，肌肉特異性蛋白MG53在骨骼肌細胞膜的修復(fù)過程中起重要作用，并

2、發(fā)現(xiàn)其對心肌細胞的急性缺氧、氧化應(yīng)激及缺血再灌注損傷起到保護作用，但MG53在骨骼肌缺血缺氧損傷中的相關(guān)研究現(xiàn)尚未見報道。因此，本課題推測MG53能夠在急性肢體缺血過程中對骨骼肌起到一定的保護作用。本研究主要探索MG53是否能夠?qū)毙灾w缺血過程中骨骼肌的損傷起到修復(fù)和保護作用以及相關(guān)作用機制。
　　實驗材料與方法
　　1、實驗動物及主要試劑
　　200～250g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠及2～3天新

3、生雌雄不限SD大鼠購買于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;CoC(l)2、MTT、二甲基亞砜購買于sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購買于HyClone公司;HIF-1α、MG53、BAX、Bcl-2、p27、GAPDH蛋白抗體購買于SantaCruz公司，流式細胞凋亡和增殖檢測試劑盒購買于BD公司。
　　2、動物模型
　　200～250g雄性SD大鼠共30只，分為5組（每組6只），包括對照組(0h)6只，實驗組根據(jù)

4、不同的結(jié)扎時間分為4h、8h、12h和24h。所有大鼠經(jīng)10％水合氯醛腹腔麻醉，實驗組使用7-0血管線結(jié)扎左側(cè)髂內(nèi)、外動脈和股動脈，對照組僅暴露左側(cè)髂內(nèi)外動脈及股動脈而不結(jié)扎。不同時間點處死后切取肌肉標(biāo)本，4％多聚甲醛固定或液氮中凍存。
　　3、蘇木精和伊紅染色
　　骨骼肌組織福爾馬林固定，二甲苯酒精脫水，石蠟包埋切片。嚴格按照標(biāo)準蘇木精和伊紅染色步驟，在普通光學(xué)顯微鏡(TE2000-S，Nikon,Japan)下觀察結(jié)果。

5、
　　4、透射電子顯微鏡觀察
　　骨骼肌組織經(jīng)2.5％戊二醛固定，四氧化鋨固定及環(huán)氧樹脂包埋，再經(jīng)半薄切片，用1％甲苯胺藍染色，在光鏡下觀察，并對合適的區(qū)域進行修整，超薄切片經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在透射顯微鏡JEM-1200EX(Jeol，Tokyo，Japan)下觀察結(jié)果。
　　5、乳酸脫氫酶及肌酸激酶檢測
　　采集大鼠血樣并收集在富含EDTA的離心管中，離心取上清置-70℃冷凍儲存，所有樣本均經(jīng)全自動分

6、析儀(Au2700，Olympus，Japan)檢測。
　　6、細胞培養(yǎng)
　　大鼠骨骼肌來自于2～3天新生SD大鼠的四肢。貼壁法培養(yǎng)原代大鼠骨骼肌細胞，細胞被傳代3～6次，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，應(yīng)用含10％血清的高糖DMEM培養(yǎng)。
　　7、免疫熒光染色
　　骨骼肌細胞以104密度生長于24孔板或玻片上，PBS洗滌3次，用多聚甲醛固定，5％BSA室溫封閉2小時，一抗4℃孵育過夜，熒光標(biāo)記二抗室溫孵育2小

7、時，Hoechst33258染核。在倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微成像下觀察染色情況(FV1000S-SIM/IX81,Olympus,Japan)。
　　8、免疫印跡
　　骨骼肌組織標(biāo)本或細胞置于EP管中，加入適量蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF)，勻漿機勻漿或超聲破碎細胞，離心后提取蛋白，采用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，蛋白上樣量為60μg，體積為20μl。配制10％聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉（5％脫脂牛奶）

8、、加入一抗4℃孵育過夜，洗膜45分鐘，加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)37℃孵育2小時后ECL發(fā)光（MF-ChemiBis），并計算光密度值。試驗重復(fù)3次。
　　9、慢病毒介導(dǎo)的shRNA的導(dǎo)入
　　采用MOI值為10∶1的病毒感染骨骼肌細胞，48小時后，在熒光顯微鏡(FV1000S-SIM/IX81;Olympus)下觀察GFP熒光標(biāo)記shRNA，明確感染效率。
　　10、細胞增殖檢測
　　骨骼肌細胞接種于96孔板

9、，生長至70％，經(jīng)二氯化鈷處理后依次加入MTT及DMSO，用ELISA96孔板機器(BIORAD680，USA)檢測570nm處波長，數(shù)據(jù)顯示為實驗組細胞相對對照組細胞的百分比。
　　11、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
　　細胞經(jīng)胰酶消化收集并PBS洗滌，按照BD公司AnnexinⅤ-FITC&PI凋亡試劑盒說明操作，樣本經(jīng)流式細胞儀(FACSCaliber,USA)檢測。
　　12、流式細胞術(shù)檢測細胞周期
　　胰酶消

10、化細胞，75％冰乙醇-20℃固定過夜，PBS洗滌一次，100ng/mlRNase及10ng/mlPI37℃染色1小時。流式細胞儀(FACSCaliber,USA)檢測細胞周期，同時ModFitLT3.0軟件分析細胞周期分布情況。
　　13、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差表示。組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果
　　1、急性缺血模型中骨骼肌和相關(guān)酶類的變化
　　急

11、性缺血模型是通過結(jié)扎左側(cè)髂內(nèi)、外動脈及股動脈構(gòu)成的。為了研究骨骼肌在急性缺血時組織形態(tài)學(xué)的變化，我們于不同缺血時間點進行HE染色。結(jié)果顯示，在對照組中HE染色無任何明顯變化，肌纖維排列規(guī)整，胞膜完整;實驗組缺血4h、8h、12h和24h肌纖維受到損害，肌纖維寬窄不一，胞漿染色變淺，特別在缺血8h，而12h和24h未見明顯加重。在透射電鏡下也觀察到相同的結(jié)果。此外，乳酸脫氫酶及肌酸激酶的檢測也證明了以上的結(jié)論。在缺血4h和8h乳酸脫氫酶及

12、肌酸激酶釋放量升高最明顯，在8h達到高峰。實驗證明，在急性缺血過程中骨骼肌存在著特異性的變化趨勢。
　　2、急性肢體缺血導(dǎo)致進行性骨骼肌損傷對MG53和HIF-1α表達的影響
　　為研究MG53和HIF-1α表達與骨骼肌完整性之間是否存在一定聯(lián)系，通過實時定量PCR和免疫印跡來檢測MG53和HIF-1α在急性肢體缺血模型中的表達情況。數(shù)據(jù)顯示在急性缺血過程中，mRNA和蛋白水平上發(fā)現(xiàn)MG53和HIF-1α的表達呈進行性升高。

13、實驗結(jié)果顯示，在急性缺血過程中，MG53和HIF-1α可能存在相似的變化趨勢。
　　3、氯化鈷誘導(dǎo)原代骨骼肌細胞急性缺氧模型中MG53和HIF-1α的表達趨勢
　　采用特異性抗體橫紋肌肌動蛋白鑒定原代培養(yǎng)的骨骼肌細胞。經(jīng)過200uM氯化鈷處理原代骨骼肌細胞分別于0h（對照組）、4h、8h、12h和24h檢測MG53和HIF-1α的表達趨勢。結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧的骨骼肌細胞活力明顯下降，同時也伴隨著MG53和HIF-1

14、αmRNA和蛋白水平上有相同升高的趨勢，實驗進一步證明兩者之間可能存在的相關(guān)性。
　　4、二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細胞凋亡和阻滯細胞周期進程
　　二氯化鈷處理的骨骼肌細胞活力隨時間的延長而下降?？沟蛲龅鞍譈cl-2與骨骼肌細胞活力的趨勢相似，而促凋亡蛋白BAX則隨著時間的延長而上升，與骨骼肌細胞活力相反。流式細胞術(shù)檢測骨骼肌細胞凋亡明顯增加。實驗證明二氯化鈷能誘導(dǎo)骨骼肌細胞凋亡。同樣，二氯化鈷處理的骨骼肌細胞G0/G1期明顯增多，

15、S期明顯減少。同樣細胞周期抑制蛋白p27蛋白表達明顯增加，因此我們認為二氯化鈷能夠阻滯骨骼細胞周期進程，促使細胞聚集在G0/G1期。
　　5、HIF-1α和MG53對骨骼肌細胞的影響
　　采用慢病毒載體攜帶HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分別將其表達抑制，結(jié)果顯示:與對照組相比，HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA細胞凋亡明顯增加，抑制細胞周期進程;施加二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細胞后，結(jié)果顯示:與對照組相比

16、，HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA細胞凋亡和細胞周期抑制更加明顯。說明HIF-1α和MG53的缺失能夠引起骨骼肌細胞的損傷，在缺氧條件下能夠加重損傷。再次說明兩者對骨骼肌細胞具有相似的作用。
　　6、HIF-1α和MG53之間的關(guān)系
　　采用慢病毒載體攜帶HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分別將其表達抑制，轉(zhuǎn)染后免疫印跡顯示HIF-1α的沉默表達能夠抑制HIF-1α和MG53的表達。相反，MG53的

17、下調(diào)僅抑制其本身的表達。因此，推測MG53可能是由HIF-1α調(diào)控的一個新下游因子。
　　結(jié)論
　　1、急性下肢缺血過程中骨骼肌損傷存在特異性的變化趨勢;
　　2、急性下肢缺血過程中HIF-1α和MG53表達進行性升高;
　　3、二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細胞缺氧過程中HIF-1α和MG53表達進行性升高;
　　4、二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細胞凋亡和阻滯細胞周期進程;
　　5、HIF-1α和MG53對骨骼肌細胞起到