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文檔簡介
1、目的
急性肢體缺血是血管外科最常見的疾病之一,其致殘率和死亡率高,主要原因是由于手術中長時間的動脈夾閉、急性動脈血栓形成、動脈栓塞、創(chuàng)傷及血管損傷等,該病起病急劇,疼痛劇烈,且多在活動中突然發(fā)生,一旦肢體供血的主動脈突然中斷,使遠端肢體處于缺血缺氧狀態(tài),如持續(xù)發(fā)展會導致組織細胞功能失調(diào)甚至死亡。因此,早期明確診斷和治療對于血管外科醫(yī)生是一個極大的挑戰(zhàn)。最近研究發(fā)現(xiàn),肌肉特異性蛋白MG53在骨骼肌細胞膜的修復過程中起重要作用,并
2、發(fā)現(xiàn)其對心肌細胞的急性缺氧、氧化應激及缺血再灌注損傷起到保護作用,但MG53在骨骼肌缺血缺氧損傷中的相關研究現(xiàn)尚未見報道。因此,本課題推測MG53能夠在急性肢體缺血過程中對骨骼肌起到一定的保護作用。本研究主要探索MG53是否能夠?qū)毙灾w缺血過程中骨骼肌的損傷起到修復和保護作用以及相關作用機制。
實驗材料與方法
1、實驗動物及主要試劑
200~250g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠及2~3天新
3、生雌雄不限SD大鼠購買于中國醫(yī)科大學實驗動物中心;CoC(l)2、MTT、二甲基亞砜購買于sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購買于HyClone公司;HIF-1α、MG53、BAX、Bcl-2、p27、GAPDH蛋白抗體購買于SantaCruz公司,流式細胞凋亡和增殖檢測試劑盒購買于BD公司。
2、動物模型
200~250g雄性SD大鼠共30只,分為5組(每組6只),包括對照組(0h)6只,實驗組根據(jù)
4、不同的結扎時間分為4h、8h、12h和24h。所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉,實驗組使用7-0血管線結扎左側髂內(nèi)、外動脈和股動脈,對照組僅暴露左側髂內(nèi)外動脈及股動脈而不結扎。不同時間點處死后切取肌肉標本,4%多聚甲醛固定或液氮中凍存。
3、蘇木精和伊紅染色
骨骼肌組織福爾馬林固定,二甲苯酒精脫水,石蠟包埋切片。嚴格按照標準蘇木精和伊紅染色步驟,在普通光學顯微鏡(TE2000-S,Nikon,Japan)下觀察結果。
5、
4、透射電子顯微鏡觀察
骨骼肌組織經(jīng)2.5%戊二醛固定,四氧化鋨固定及環(huán)氧樹脂包埋,再經(jīng)半薄切片,用1%甲苯胺藍染色,在光鏡下觀察,并對合適的區(qū)域進行修整,超薄切片經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,在透射顯微鏡JEM-1200EX(Jeol,Tokyo,Japan)下觀察結果。
5、乳酸脫氫酶及肌酸激酶檢測
采集大鼠血樣并收集在富含EDTA的離心管中,離心取上清置-70℃冷凍儲存,所有樣本均經(jīng)全自動分
6、析儀(Au2700,Olympus,Japan)檢測。
6、細胞培養(yǎng)
大鼠骨骼肌來自于2~3天新生SD大鼠的四肢。貼壁法培養(yǎng)原代大鼠骨骼肌細胞,細胞被傳代3~6次,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中,應用含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)。
7、免疫熒光染色
骨骼肌細胞以104密度生長于24孔板或玻片上,PBS洗滌3次,用多聚甲醛固定,5%BSA室溫封閉2小時,一抗4℃孵育過夜,熒光標記二抗室溫孵育2小
7、時,Hoechst33258染核。在倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微成像下觀察染色情況(FV1000S-SIM/IX81,Olympus,Japan)。
8、免疫印跡
骨骼肌組織標本或細胞置于EP管中,加入適量蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF),勻漿機勻漿或超聲破碎細胞,離心后提取蛋白,采用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度,蛋白上樣量為60μg,體積為20μl。配制10%聚丙烯酰胺凝膠,煮樣后電泳、轉膜、封閉(5%脫脂牛奶)
8、、加入一抗4℃孵育過夜,洗膜45分鐘,加入過氧化物酶標記的二抗,經(jīng)37℃孵育2小時后ECL發(fā)光(MF-ChemiBis),并計算光密度值。試驗重復3次。
9、慢病毒介導的shRNA的導入
采用MOI值為10∶1的病毒感染骨骼肌細胞,48小時后,在熒光顯微鏡(FV1000S-SIM/IX81;Olympus)下觀察GFP熒光標記shRNA,明確感染效率。
10、細胞增殖檢測
骨骼肌細胞接種于96孔板
9、,生長至70%,經(jīng)二氯化鈷處理后依次加入MTT及DMSO,用ELISA96孔板機器(BIORAD680,USA)檢測570nm處波長,數(shù)據(jù)顯示為實驗組細胞相對對照組細胞的百分比。
11、流式細胞術檢測細胞凋亡
細胞經(jīng)胰酶消化收集并PBS洗滌,按照BD公司AnnexinⅤ-FITC&PI凋亡試劑盒說明操作,樣本經(jīng)流式細胞儀(FACSCaliber,USA)檢測。
12、流式細胞術檢測細胞周期
胰酶消
10、化細胞,75%冰乙醇-20℃固定過夜,PBS洗滌一次,100ng/mlRNase及10ng/mlPI37℃染色1小時。流式細胞儀(FACSCaliber,USA)檢測細胞周期,同時ModFitLT3.0軟件分析細胞周期分布情況。
13、統(tǒng)計學分析
所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗。P<0.05有統(tǒng)計學意義。
實驗結果
1、急性缺血模型中骨骼肌和相關酶類的變化
急
11、性缺血模型是通過結扎左側髂內(nèi)、外動脈及股動脈構成的。為了研究骨骼肌在急性缺血時組織形態(tài)學的變化,我們于不同缺血時間點進行HE染色。結果顯示,在對照組中HE染色無任何明顯變化,肌纖維排列規(guī)整,胞膜完整;實驗組缺血4h、8h、12h和24h肌纖維受到損害,肌纖維寬窄不一,胞漿染色變淺,特別在缺血8h,而12h和24h未見明顯加重。在透射電鏡下也觀察到相同的結果。此外,乳酸脫氫酶及肌酸激酶的檢測也證明了以上的結論。在缺血4h和8h乳酸脫氫酶及
12、肌酸激酶釋放量升高最明顯,在8h達到高峰。實驗證明,在急性缺血過程中骨骼肌存在著特異性的變化趨勢。
2、急性肢體缺血導致進行性骨骼肌損傷對MG53和HIF-1α表達的影響
為研究MG53和HIF-1α表達與骨骼肌完整性之間是否存在一定聯(lián)系,通過實時定量PCR和免疫印跡來檢測MG53和HIF-1α在急性肢體缺血模型中的表達情況。數(shù)據(jù)顯示在急性缺血過程中,mRNA和蛋白水平上發(fā)現(xiàn)MG53和HIF-1α的表達呈進行性升高。
13、實驗結果顯示,在急性缺血過程中,MG53和HIF-1α可能存在相似的變化趨勢。
3、氯化鈷誘導原代骨骼肌細胞急性缺氧模型中MG53和HIF-1α的表達趨勢
采用特異性抗體橫紋肌肌動蛋白鑒定原代培養(yǎng)的骨骼肌細胞。經(jīng)過200uM氯化鈷處理原代骨骼肌細胞分別于0h(對照組)、4h、8h、12h和24h檢測MG53和HIF-1α的表達趨勢。結果顯示,與對照組相比,缺氧的骨骼肌細胞活力明顯下降,同時也伴隨著MG53和HIF-1
14、αmRNA和蛋白水平上有相同升高的趨勢,實驗進一步證明兩者之間可能存在的相關性。
4、二氯化鈷誘導骨骼肌細胞凋亡和阻滯細胞周期進程
二氯化鈷處理的骨骼肌細胞活力隨時間的延長而下降??沟蛲龅鞍譈cl-2與骨骼肌細胞活力的趨勢相似,而促凋亡蛋白BAX則隨著時間的延長而上升,與骨骼肌細胞活力相反。流式細胞術檢測骨骼肌細胞凋亡明顯增加。實驗證明二氯化鈷能誘導骨骼肌細胞凋亡。同樣,二氯化鈷處理的骨骼肌細胞G0/G1期明顯增多,
15、S期明顯減少。同樣細胞周期抑制蛋白p27蛋白表達明顯增加,因此我們認為二氯化鈷能夠阻滯骨骼細胞周期進程,促使細胞聚集在G0/G1期。
5、HIF-1α和MG53對骨骼肌細胞的影響
采用慢病毒載體攜帶HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分別將其表達抑制,結果顯示:與對照組相比,HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA細胞凋亡明顯增加,抑制細胞周期進程;施加二氯化鈷誘導骨骼肌細胞后,結果顯示:與對照組相比
16、,HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA細胞凋亡和細胞周期抑制更加明顯。說明HIF-1α和MG53的缺失能夠引起骨骼肌細胞的損傷,在缺氧條件下能夠加重損傷。再次說明兩者對骨骼肌細胞具有相似的作用。
6、HIF-1α和MG53之間的關系
采用慢病毒載體攜帶HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分別將其表達抑制,轉染后免疫印跡顯示HIF-1α的沉默表達能夠抑制HIF-1α和MG53的表達。相反,MG53的
17、下調(diào)僅抑制其本身的表達。因此,推測MG53可能是由HIF-1α調(diào)控的一個新下游因子。
結論
1、急性下肢缺血過程中骨骼肌損傷存在特異性的變化趨勢;
2、急性下肢缺血過程中HIF-1α和MG53表達進行性升高;
3、二氯化鈷誘導骨骼肌細胞缺氧過程中HIF-1α和MG53表達進行性升高;
4、二氯化鈷誘導骨骼肌細胞凋亡和阻滯細胞周期進程;
5、HIF-1α和MG53對骨骼肌細胞起到
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