AMH與PCOS卵泡發(fā)育障礙機(jī)制探索及RNA干擾技術(shù)治療高雄激素血癥在體動(dòng)物研究.pdf

1、第一部分 AMH與PCOS卵泡發(fā)育障礙治療靶點(diǎn)的初步研究
　　 目的：卵泡發(fā)育障礙是多囊卵巢綜合征(PCOS)最常見(jiàn)的臨床癥狀之一，由其所致的月經(jīng)稀發(fā)和不孕是PCOS患者就診的主要原因，由于PCOS長(zhǎng)期不排卵造成子宮內(nèi)膜癌等遠(yuǎn)期并發(fā)癥對(duì)女性生殖健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。針對(duì)PCOS卵泡發(fā)育障礙機(jī)制尚未完全明確及促排卵治療低效高風(fēng)險(xiǎn)的現(xiàn)狀，本研究探討了PCOS顆粒細(xì)胞AMH啟動(dòng)子活性與其過(guò)度分泌的關(guān)系，從新的角度揭示卵泡發(fā)育障礙的病因。并

2、通過(guò)研究FSH調(diào)節(jié)PCOS顆粒細(xì)胞AMH轉(zhuǎn)錄表達(dá)的分子通路，為今后治療PCOS卵泡發(fā)育障礙探索新的靶點(diǎn)。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)共分為四組：PCOS顆粒細(xì)胞、IVM促排卵刺激PCOS顆粒細(xì)胞、添加外源性FSH刺激PCOS顆粒細(xì)胞、IVF對(duì)照顆粒細(xì)胞各15例。PCOS顆粒細(xì)胞組顆粒細(xì)胞在入組前3個(gè)月內(nèi)均未接受過(guò)任何促排卵藥物刺激或手術(shù)治療，PCOS患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)為2003年制定的Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)。PCOS+FSH組顆粒細(xì)胞也來(lái)源

3、于上一組未經(jīng)促排卵藥物刺激行卵泡穿刺術(shù)的PCOS患者。但是與前一組不同的是該組顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中添加了外源性的FSH(0.075IU/ml)。該組主要用于觀(guān)察外源性FSH對(duì)PCOS顆粒細(xì)胞AMH過(guò)度分泌的影響。IVMPCOS組顆粒細(xì)胞來(lái)源于經(jīng)內(nèi)源性FSH促排卵刺激后行卵泡穿刺術(shù)的PCOS患者，該組主要用于觀(guān)察內(nèi)源性FSH對(duì)PCOS顆粒細(xì)胞AMH過(guò)度分泌的影響。IVF對(duì)照組顆粒細(xì)胞來(lái)源于具有正常月經(jīng)周期因輸卵管因素不孕在本中心行IV

4、F-ET手術(shù)的不孕患者，患者均采用長(zhǎng)方案進(jìn)行控制性卵巢刺激。以上各組患者均在B超引導(dǎo)下采用20G取卵針經(jīng)陰道穿刺8-10mm大小的竇卵泡。在卵泡穿刺過(guò)程中采用加肝素的PBS緩沖液沖洗取卵針，收集所有沖洗液用于分離顆粒細(xì)胞。顆粒細(xì)胞的分離純化采用密度梯度離心法，之后將分離純化后的顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)48小時(shí)，并收集培養(yǎng)液和顆粒細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)。分別采用ELISA和qRT-PCR檢測(cè)AMH分泌水平及mRNA的表達(dá)豐度，同時(shí)采用qRT-

5、PCR和Western-lot比較各組顆粒細(xì)胞AMHRⅡ mRNA和蛋白的表達(dá)差異，構(gòu)建hAMH-Juc雙熒光報(bào)道基因載體研究AMH啟動(dòng)子活性及FGH對(duì)其活性的分子調(diào)控通路。
　　 結(jié)果：收集各組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液測(cè)定AMH分泌水平為：PCOS顆粒細(xì)胞組11.41±3.99ng/ml、PCOS顆粒細(xì)胞添加外源性FSH組7.91±1.09ng/m1、PCOSIVM顆粒細(xì)胞組5.62±1.71ng/ml、IVF對(duì)照顆粒細(xì)胞組4.78±0

6、.94ng/ml。收集顆粒細(xì)胞提取總RNA測(cè)定AMH mRNA的表達(dá)豐度，結(jié)果顯示PCOS顆粒細(xì)胞組AMH mRNA表達(dá)豐度顯著高于IVF對(duì)照組，添加外源性FSH或IVM方促排卵刺激均能夠抑制PCOS顆粒細(xì)胞AMH mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，尤其以后者的抑制效果更顯著。PCOS顆粒細(xì)胞組AMHRⅡ mRNA的表達(dá)豐度顯著高于IVF對(duì)照組，添加外源性FSH或IVM促排卵刺激對(duì)其表達(dá)無(wú)顯著影響。收集顆粒細(xì)胞提取總蛋白測(cè)定AMHRⅡ的蛋白表達(dá)水平，

7、其結(jié)果與mRNA表達(dá)一致。PCOS顆粒細(xì)胞組AMHRⅡ蛋白表達(dá)水平顯著高于IVF對(duì)照組，添加外源性FSH或IVM促排卵刺激對(duì)其表達(dá)無(wú)顯著影響。構(gòu)建hAMH-luc載體檢測(cè)PCOS顆粒細(xì)胞AMH啟動(dòng)子活性顯著高于對(duì)照組，而添加外源性FSH能夠顯著抑制AMH啟動(dòng)子活性。
　　 結(jié)論：AMH啟動(dòng)子活性異常增高所致的轉(zhuǎn)錄水平增加是導(dǎo)致PCOS顆粒細(xì)胞AMH過(guò)度分泌的重要原因。FSH能夠抑制PCOS顆粒細(xì)胞AMH啟動(dòng)子活性和轉(zhuǎn)錄表達(dá)，削弱

8、其對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的抑制作用從而達(dá)到促排卵的目的，但對(duì)AMHRⅡ的影響不大。本研究從新的角度解釋了FSH的促排卵機(jī)制，可能為PCOS卵泡發(fā)育障礙的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 第二部分LH升高和非升高型PCOS患者AMH分泌特點(diǎn)及卵泡發(fā)育障礙機(jī)制比較
　　 目的：多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見(jiàn)的婦科疾病之一，由卵泡發(fā)育障礙所致的不孕、月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)是患者就診的主要原因[1-3]。由于臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性，先前就有學(xué)者

9、提出PCOS患者可以分為兩種類(lèi)型，LH升高型和非升高型。這兩種亞型的患者都存在不同程度的排卵障礙，本研究比較這兩種亞型AMH的分泌特點(diǎn)及卵泡發(fā)育障礙的機(jī)制。
　　 方法：本研究共納入95名PCOS患者，患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為2003制定的Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)LH/FSH比值將PCOS患者分為L(zhǎng)H升高型(LH/FSH≥2)和非升高型(LH/FSH＜2)。其中LH升高型49例，LH非升高型46例。研究還納入62名具有正常月經(jīng)周期輸

10、卵管性不孕的患者作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均測(cè)定BMI指數(shù)，并采用ELISA和化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清中AMH、卵巢性激素、糖脂代謝生化指標(biāo)及慢性炎癥因子的水平。采用單因素方差分析法比較各組間生化代謝指標(biāo)的差異，采用簡(jiǎn)單相關(guān)分析法和多重線(xiàn)性回歸分析法研究AMH與各生化代謝指標(biāo)的關(guān)系。
　　 結(jié)果：LH非升高型PCOS患者的BMI、空腹胰島素、HOMA-IR、TG、TG/HDL水平均顯著高于LH升高型和對(duì)照組，而LH升高型PCOS患者的L

11、H、LH/FSH、T水平均顯著高于LH非升高型和對(duì)照組。通過(guò)比較各組AMH血清水平發(fā)現(xiàn)，LH升高型PCOS患者、LH非升高型PCOS患者及對(duì)照組患者血清AMH水平分別為7.23±4.34 ng/ml、5.23±3.76 ng/ml、3.74±2.25ng/ml。PCOS組患者血清AMH水平顯著高于對(duì)照組，且LH升高型高于非升高型。兩種亞型的PCOS患者AMH血清水平均顯著高于對(duì)照組，但是LH升高型PCOS患者的AMH血清水平又顯著高于L

12、H非升高型。此外，PCOS患者血清CRP和IL-6水平均顯著高于對(duì)照組，但兩種亞型之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 采用Pearson相關(guān)法分析LH升高型PCOS患者AMH血清水平與各生化指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示LH升高型PCOS患者的AMH血清水平與E2呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.318。LH非升高型PCOS患者的AMH血清水平與BMI、空腹血糖、HOMA-IR呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.493、0.362、0.303，與HDL呈負(fù)相關(guān)，

13、相關(guān)系數(shù)為-0.309。采用多重線(xiàn)性回歸法控制其它因素的影響后，LH升高型PCOS患者的AMH血清水平與LH/FSH呈正相關(guān)，與E2呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.301和-0.429。LH非升高型PCOS患者的血清AMH水平僅與BMI呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.49。
　　 結(jié)論：我們首次從AMH的角度揭示了LH升高型和非升高型卵泡發(fā)育障礙的機(jī)制可能存在差異，這將為PCOS患者個(gè)體化治療方案的制定提供依據(jù)。但是由于本研究?jī)H為病例對(duì)照研

14、究，無(wú)法進(jìn)一步分析AMH與各臨床生化指標(biāo)的因果關(guān)系，因此還需要更大樣本的前瞻性研究來(lái)證實(shí)本研究的結(jié)論。
　　 第三部分 RNAi抑制高雄激素分泌治療PCOS卵泡發(fā)育障礙在體動(dòng)物研究
　　 目的：17α羥化酶/17，20斷裂酶由CYP17基因編碼是雄激素代謝途徑中的限速酶。CYP17轉(zhuǎn)錄水平增加所致的17α羥化酶/17，20斷裂酶活性亢進(jìn)是引起PCOS雄激素過(guò)度分泌的重要原因。本研究將CYP17基因選為治療的靶點(diǎn)，采用RN

15、A干擾技術(shù)沉默該基因在大鼠卵巢組織中的表達(dá)，部分抑制17α羥化酶/17，20斷裂酶的活性，從而抑制卵巢雄激素的過(guò)度分泌。
　　 方法：針對(duì)大鼠CYP17基因構(gòu)建3條慢病毒shRNA，分別感染體外分離純化培養(yǎng)的大鼠卵巢膜間質(zhì)細(xì)胞。卵巢膜間質(zhì)細(xì)胞的分離純化采用密度梯度離心法。慢病毒感染卵巢膜間細(xì)胞1周后，采用qRT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測(cè)CYP17基因的mRNA和蛋白沉默水平。并采用ELISA技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液中雄烯二

16、酮的分泌水平，體外篩選出沉默效率最高的慢病毒shRNA用于整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用2個(gè)月大SP級(jí)雌性SD大鼠共18只，體重為200g，置于SP級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分三組：CYP17干擾組、NS對(duì)照組、空白對(duì)照組，平均每組6只大鼠。將慢病毒卵巢被膜下注射至大鼠雙側(cè)卵巢，觀(guān)察GFP熒光并采用qRT-PCR檢測(cè)GFP在卵巢組織中的感染效率。提取大鼠卵巢組織總RNA用于CYP17mRNA豐度的檢測(cè)，收集血清用于卵巢甾體類(lèi)激素的測(cè)定。

17、　　 結(jié)果：所構(gòu)建的3條慢病毒CYP17 shRNA對(duì)CYP17基因均有不同程度地沉默作用。由于慢病毒CYP17shRNA2＃作用最穩(wěn)定，最終選取該條慢病毒shRNA用于整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過(guò)大鼠卵巢被膜下注射慢病毒CYP17 shRNA2＃2周后，將卵巢組織制作冰凍切片，熒光鏡下觀(guān)察可見(jiàn)明顯的GFP熒光。GFP qRT-PCR顯示慢病毒注射組的GFP mRNA水平顯著增高，其相對(duì)表達(dá)水平是空白對(duì)照組的7.42倍。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)證卵巢被膜下

18、注射的慢病毒已成功感染至卵巢組織。同時(shí)，CYP17 qRT-PCR顯示RNA干擾組的CYP17 mRNA豐度顯著降低，平均抑制率達(dá)61％。激素測(cè)定結(jié)果顯示，RNA干擾組的雄烯二酮、17羥孕酮、睪酮均有一定程度地降低，另外孕酮水平也有下降且差異有顯著性。
　　 結(jié)論：本研究首次證明采用RNA干擾技術(shù)沉默CYP17基因能夠一定程度地抑制卵巢雄激素的合成，這不僅為治療PCOS等高雄激素疾病提供了新的思路，并且為RNA干擾技術(shù)在內(nèi)分泌代