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文檔簡(jiǎn)介
1、研究目的
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病?;ぱ壮志梅磸?fù)發(fā)作,可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞,關(guān)節(jié)功能障礙,甚至殘廢。本病呈全球性分布,患病率約為1%。我國(guó)的患病率約為0.32%~0.36%,是造成我國(guó)勞動(dòng)力喪失和致殘的主要疾病之一。
RA的主要病理改變是滑膜炎,具有類(lèi)腫瘤樣生長(zhǎng)的特點(diǎn),表現(xiàn)為滑膜組織的肥厚增生,血管翳形成,對(duì)關(guān)節(jié)周
2、圍的組織產(chǎn)生侵蝕和破壞。RA的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明,人們逐漸認(rèn)識(shí)到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)可能是RA的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用的細(xì)胞因子,并對(duì)其展開(kāi)了深入研究。目前除抗炎及對(duì)癥治療外還沒(méi)有特效的治療方法。隨著人們對(duì)血管生成與RA的了解,抗血管生成治療成為新的研究熱點(diǎn)。雷公藤多苷(Tripterygiumglucosides)是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)作用的中藥制劑,對(duì)RA
3、有一定療效。雷公藤作為目前治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中療效最被肯定的單味中藥,主要有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗菌、抗生育等作用,對(duì)于前兩個(gè)作用的研究比較深入,但抗血管生成作用機(jī)制以及相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究較少。
本研究通過(guò)觀察雷公藤多苷對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體2(VEGFR2)表達(dá)水平的影響,研究雷公藤多苷治療RA中的抗血管生成作用,并闡明其可能作用機(jī)制,為
4、臨床合理應(yīng)用雷公藤多苷治療RA病人提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
研究方法
1、設(shè)計(jì)VEGF和VEGFR2的引物和探針,建立檢測(cè)VEGF和VEGFR2mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,并評(píng)估其特異性、重復(fù)性。
2、建立CIA大鼠模型,造模成功后用雷公藤多苷干預(yù),并以沙利度胺作為陽(yáng)性對(duì)照。
3、利用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)雷公藤多苷對(duì)CIA模型大鼠VEGF和VEGFR2基因表達(dá)的
5、影響,并用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量。
4、對(duì)VEGF基因在健康大鼠組織(肺、心、肝臟、腎臟、腦、胃、腸和頜下腺)特異性表達(dá)進(jìn)行分析。
5、對(duì)RA患者滑膜組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)成功后用雷公藤多苷進(jìn)行干預(yù),觀察分析VEGF和VEGFR2的表達(dá)情況。
結(jié)果
1、經(jīng)DNA測(cè)序和電泳分析,檢測(cè)VEGF和VEGFR2的擴(kuò)增分析是特異的,定量分析其相關(guān)系數(shù)均>0
6、.98,大鼠VEGF和VEGFR2mRNA檢測(cè)的重復(fù)性好,其批內(nèi)變異系數(shù)(CV)分別為2.0%~6.7%和2.0%~6.4%,批間變異系數(shù)(CV)分別為3.5%~10.6%和3.6%~10.2%。
2、模型組大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分和腫脹度與正常組相比有明顯差異(P<0.01),其滑膜組織病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜被覆細(xì)胞變性、增生,滑膜間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn),并有肉芽組織形成,關(guān)節(jié)軟骨有不同程度的損傷,進(jìn)而纖維組織增生、關(guān)節(jié)局部纖維化,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致
7、關(guān)節(jié)腔消失。關(guān)節(jié)周?chē)は萝浗M織內(nèi)見(jiàn)“Ⅱ型膠原”引起的遲發(fā)性交態(tài)反應(yīng),局部有多量的類(lèi)上皮細(xì)胞增生呈結(jié)節(jié)狀,并有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
3、雷公藤多苷組、沙利度胺組大鼠各組織中VEGF和VEGFR2mRNA均低于模型對(duì)照組(P<0.05),與沙利度胺組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。
4、健康大鼠肺組織中VEGFmRNA表達(dá)最高,與其他任意組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),其它各組織間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
8、5、模型組大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05),雷公藤多苷組、沙利度胺組大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量低于模型對(duì)照組(P<0.05)。
6、雷公藤多苷干預(yù)RA患者滑膜細(xì)胞后,VEGF和VEGFR2mRNA的水平明顯下降((P<0.05)。
結(jié)論
本研究成功建立了準(zhǔn)確定量分析VEGF和VEGFR2mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法;通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)研
9、究,結(jié)果表明,雷公藤多苷治療RA具有療效,其作用機(jī)制可能與通過(guò)降低VEGF和VEGFR2表達(dá)水平,有效抑制血管生成有關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在:(1)近年來(lái)對(duì)VEGF的研究較多,但對(duì)其基因表達(dá)的研究常采用分子雜交和常規(guī)RT-PCR等半定量的方法,其定量的準(zhǔn)確性不足,變異也比較大,進(jìn)而對(duì)研究結(jié)論的可靠性有一定的影響。本研究建立的檢測(cè)大鼠組織中VEGF和VEGFR2mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,首次將絕對(duì)定量與相對(duì)定量
10、結(jié)合,其定量分析的準(zhǔn)確度和靈敏度均遠(yuǎn)高于以前的方法。(2)對(duì)健康大鼠不同部位組織VEGF特異性表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)分析,為以后研究在疾病大鼠模型中表達(dá)水平奠定了基礎(chǔ),國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。(3)首次應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行VEGFR2mRNA的檢測(cè)。(4)雷公藤作為目前治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中療效最被肯定的單味中藥,其抗炎、免疫抑制作用的研究比較深入,但抗血管生成作用機(jī)制以及相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究較少,本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn),比較系統(tǒng)地
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