肉桂酰天冬氨酸類氨肽酶N抑制劑的設計、合成及其生物活性研究.pdf

1、研究背景：氨肽酶N(APN/CDl3)是一類鋅離子依賴型的膜結合型外肽酶，在許多組織細胞包括腎臟、小腸、肝臟及中樞神經系統(tǒng)中廣泛表達。它能影響免疫功能和主要的生物學過程，包括細胞的增殖、分泌、侵入、血管發(fā)生等，參與細胞基質的水解和內源性生物活性分子腦啡肽和內啡肽降解的失活。另外，氨肽酶N也是人冠狀病毒TEGV和229E的受體。研究證明，APN在腫瘤發(fā)生、機體免疫功能調節(jié)以及病毒感染中發(fā)揮著重要的作用：(1)降解細胞外基質，促進原發(fā)腫瘤的

2、生長侵襲，有利于腫瘤細胞的侵襲轉移，促進腫瘤生長；(2)氨肽酶N是腫瘤新生血管的調節(jié)器，可以促進腫瘤新生血管的形成，在腫瘤細胞試驗中發(fā)現，APN表達可增強腫瘤細胞的侵襲力；(3)降解胸腺肽和白介素，降低機體免疫機能，加速腫瘤轉移惡化。研究證明，氨肽酶N參與多種細胞表面肽酶的連續(xù)降解過程，因此是研究抗腫瘤抗病毒藥物的一個重要靶點。
　　 本研究以氨肽酶N為靶點，根據E.Coli氨肽酶N(eAPN)的三維晶體結構以及Bestatin

3、與eAPN作用模式，通過計算機輔助合理藥物設計，合成了四個系列共88個肉桂酰天冬氨酸類衍生物，并對它們進行初步的活性篩選，以期發(fā)現具有良好的氨肽酶N抑制活性的抗癌先導化合物。
　　 研究方法：本研究以Bestatin作為先導物，利用計算機輔助藥物設計技術，尋找到與eAPN活性中心區(qū)域匹配良好的肉桂酰天冬氨酸骨架。利用計算機Sybyl軟件系統(tǒng)將該骨架和Bestatin的母核AHPA進行比對，發(fā)現二者與eAPN的活性中心作用模式相似

4、，并且表面的靜電勢也極為相似。在構建的母核肉桂酰天冬氨酸結構基礎上，將不同的結構片段與之拼接后再利用柔性對接模擬目標化合物與靶酶的作用模式，依此對肉桂酰天冬氨酸骨架的側鏈進行結構修飾，合理設計目標化合物。
　　 本研究以L-天冬氨酸作為起始原料，經甲酯化，縮合、水解、環(huán)合等反應得到關鍵中間體環(huán)狀酸酐，再經氨解反應和縮合反應得到目標化合物。其化學結構經過紅外光譜，電噴霧質譜和核磁共振譜得到確證。經查閱文獻證實，所合成的目標化合物為

5、新型化合物，未見文獻報道。
　　 實驗結果：本研究對設計、合成的四個系列的88個肉桂酰天冬氨酸骨架結構的化合物進行了體外初步生物活性評價，體外抑酶活性實驗顯示大部分化合物對氨肽酶N具有抑制活性，其中化合物B2，B4，B11，B15，B16，B17，B18和D1顯示了較好的抑酶活性。初步構效關系分析顯示，含有苯環(huán)和短脂肪鏈的氨基側鏈的化合物活性較強。芳環(huán)上取代基的種類和位置不同也影響目標化合物的活性，一般是供電子基取代的活性優(yōu)于吸

6、電子基取代的，鄰對位取代優(yōu)于間位取代。但是含有羥肟酸結構的化合物抑酶活性明顯高于含羧基的化合物?？赡苁橇u肟酸的結構更利于目標化合物與鋅離子螯合，也更容易伸入活性中心的疏水性口袋的緣故。其中化合物B2，B15，D1的IC50分別為的5.9μM，11.1μM和6.7μM，接近于陽性對照藥Bestatin(IC50∶3.6±0.6μM)的氨肽酶N抑制水平。
　　 通過MTT法體外細胞實驗測定了目標化合物對白血病細胞HL-60的生長抑制

7、作用，結果顯示對APN酶抑制作用強的化合物如B2，B11，B12，D1同樣具有很強的HL-60細胞抑制活性。B2、B11和D1的IC50分別為0.59±0.06 mM、0.47±0.04mM和0.57±0.08mM，均超過了Bestatin(IC50=0.66±0.07 mM)。
　　 結論：本研究基于氨肽酶N的晶體結構及抑制劑與酶的作用模式，充分利用了計算機輔助藥物設計軟件的優(yōu)勢，對已知活性化合物構建藥效團并對所構建的小分子化

8、合物庫進行虛擬篩選，發(fā)現了匹配良好的肉桂酰天冬氨酸骨架。通過深入研究E.Coli APN的三維結構以及酶-抑制劑復合物的結合模式，用柔性對接來模擬目標化合物與靶酶的相互作用，對肉桂酰天冬氨酸骨架的側鏈進行合理設計并實現定向合成。所設計的合成路線科學合理，原料經濟易得，且在細胞培養(yǎng)中未見明顯的細胞毒作用。通過初步的活性篩選，發(fā)現了多個活性較強，結構全新的抗癌先導化合物，具有進一步研究的價值。同時基于化合物結構和活性數據建立了有一定預測能力