肉桂酰天冬氨酸類氨肽酶N抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及其生物活性研究.pdf

1、研究背景：氨肽酶N(APN/CDl3)是一類鋅離子依賴型的膜結(jié)合型外肽酶，在許多組織細(xì)胞包括腎臟、小腸、肝臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)。它能影響免疫功能和主要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞的增殖、分泌、侵入、血管發(fā)生等，參與細(xì)胞基質(zhì)的水解和內(nèi)源性生物活性分子腦啡肽和內(nèi)啡肽降解的失活。另外，氨肽酶N也是人冠狀病毒TEGV和229E的受體。研究證明，APN在腫瘤發(fā)生、機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)以及病毒感染中發(fā)揮著重要的作用：(1)降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)原發(fā)腫瘤的

2、生長侵襲，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤生長；(2)氨肽酶N是腫瘤新生血管的調(diào)節(jié)器，可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，在腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，APN表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力；(3)降解胸腺肽和白介素，降低機(jī)體免疫機(jī)能，加速腫瘤轉(zhuǎn)移惡化。研究證明，氨肽酶N參與多種細(xì)胞表面肽酶的連續(xù)降解過程，因此是研究抗腫瘤抗病毒藥物的一個(gè)重要靶點(diǎn)。
　　 本研究以氨肽酶N為靶點(diǎn)，根據(jù)E.Coli氨肽酶N(eAPN)的三維晶體結(jié)構(gòu)以及Bestatin

3、與eAPN作用模式，通過計(jì)算機(jī)輔助合理藥物設(shè)計(jì)，合成了四個(gè)系列共88個(gè)肉桂酰天冬氨酸類衍生物，并對它們進(jìn)行初步的活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有良好的氨肽酶N抑制活性的抗癌先導(dǎo)化合物。
　　 研究方法：本研究以Bestatin作為先導(dǎo)物，利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，尋找到與eAPN活性中心區(qū)域匹配良好的肉桂酰天冬氨酸骨架。利用計(jì)算機(jī)Sybyl軟件系統(tǒng)將該骨架和Bestatin的母核AHPA進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)二者與eAPN的活性中心作用模式相似

4、，并且表面的靜電勢也極為相似。在構(gòu)建的母核肉桂酰天冬氨酸結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，將不同的結(jié)構(gòu)片段與之拼接后再利用柔性對接模擬目標(biāo)化合物與靶酶的作用模式，依此對肉桂酰天冬氨酸骨架的側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合理設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物。
　　 本研究以L-天冬氨酸作為起始原料，經(jīng)甲酯化，縮合、水解、環(huán)合等反應(yīng)得到關(guān)鍵中間體環(huán)狀酸酐，再經(jīng)氨解反應(yīng)和縮合反應(yīng)得到目標(biāo)化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過紅外光譜，電噴霧質(zhì)譜和核磁共振譜得到確證。經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實(shí)，所合成的目標(biāo)化合物為

5、新型化合物，未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本研究對設(shè)計(jì)、合成的四個(gè)系列的88個(gè)肉桂酰天冬氨酸骨架結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行了體外初步生物活性評(píng)價(jià)，體外抑酶活性實(shí)驗(yàn)顯示大部分化合物對氨肽酶N具有抑制活性，其中化合物B2，B4，B11，B15，B16，B17，B18和D1顯示了較好的抑酶活性。初步構(gòu)效關(guān)系分析顯示，含有苯環(huán)和短脂肪鏈的氨基側(cè)鏈的化合物活性較強(qiáng)。芳環(huán)上取代基的種類和位置不同也影響目標(biāo)化合物的活性，一般是供電子基取代的活性優(yōu)于吸

6、電子基取代的，鄰對位取代優(yōu)于間位取代。但是含有羥肟酸結(jié)構(gòu)的化合物抑酶活性明顯高于含羧基的化合物?？赡苁橇u肟酸的結(jié)構(gòu)更利于目標(biāo)化合物與鋅離子螯合，也更容易伸入活性中心的疏水性口袋的緣故。其中化合物B2，B15，D1的IC50分別為的5.9μM，11.1μM和6.7μM，接近于陽性對照藥Bestatin(IC50∶3.6±0.6μM)的氨肽酶N抑制水平。
　　 通過MTT法體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測定了目標(biāo)化合物對白血病細(xì)胞HL-60的生長抑制

7、作用，結(jié)果顯示對APN酶抑制作用強(qiáng)的化合物如B2，B11，B12，D1同樣具有很強(qiáng)的HL-60細(xì)胞抑制活性。B2、B11和D1的IC50分別為0.59±0.06 mM、0.47±0.04mM和0.57±0.08mM，均超過了Bestatin(IC50=0.66±0.07 mM)。
　　 結(jié)論：本研究基于氨肽酶N的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑與酶的作用模式，充分利用了計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件的優(yōu)勢，對已知活性化合物構(gòu)建藥效團(tuán)并對所構(gòu)建的小分子化

8、合物庫進(jìn)行虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了匹配良好的肉桂酰天冬氨酸骨架。通過深入研究E.Coli APN的三維結(jié)構(gòu)以及酶-抑制劑復(fù)合物的結(jié)合模式，用柔性對接來模擬目標(biāo)化合物與靶酶的相互作用，對肉桂酰天冬氨酸骨架的側(cè)鏈進(jìn)行合理設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)定向合成。所設(shè)計(jì)的合成路線科學(xué)合理，原料經(jīng)濟(jì)易得，且在細(xì)胞培養(yǎng)中未見明顯的細(xì)胞毒作用。通過初步的活性篩選，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)活性較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)全新的抗癌先導(dǎo)化合物，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。同時(shí)基于化合物結(jié)構(gòu)和活性數(shù)據(jù)建立了有一定預(yù)測能力