1，2-二氨基-3-苯丙烷類氨肽酶N抑制劑的設(shè)計、合成及其活性研究.pdf

1、氨肽酶N（Aminopeptidase N，APN），亦被稱為CD13，是一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶，廣泛存在于小腸、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種細(xì)胞表面。相比于正常細(xì)胞，該酶在腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)。研究證明氨肽酶N在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用：（1）降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進原發(fā)腫瘤的生長侵襲，有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移；（2）氨肽酶N是腫瘤新生血管的調(diào)節(jié)器，可以促進腫瘤新生血管的形成；（3）降解胸腺肽和白介素，降低機體免疫機能。世界衛(wèi)生組

2、織曾指出70％的晚期癌癥患者出現(xiàn)明顯的疼痛，癌癥引起的疼痛亦是臨床治療癌癥的一個難題，往往使用的是阿片類藥物。研究報道生物體內(nèi)具有阿片樣物質(zhì)，腦啡肽即是其中一個。但腦啡肽易被體內(nèi)的氨肽酶N所降解，令其作為鎮(zhèn)痛藥具有局限性。 正因為氨肽酶N與腫瘤的密切關(guān)系，抗氨肽酶N藥物的研究是抗腫瘤研究領(lǐng)域的一個熱點。目前的研究主要包括氨肽酶N單抗，氨肽酶N配體藥物和氨肽酶N抑制劑三方面。其中氨肽酶N單抗僅僅只是用于基礎(chǔ)研究；氨肽酶N配體藥物研

3、究已有報道APN的特異性受體NGR（asparagine-glycine-arginine）與腫瘤藥物偶聯(lián)后取得令人滿意的治療效果?？拱彪拿窷藥物研究較成熟的方面是氨肽酶N抑制劑的開發(fā)，Bestatin作為第一個上市的氨肽酶N抑制劑，臨床上已經(jīng)用于治療急性成年人非淋巴性白血病。近年又發(fā)現(xiàn)許多氨肽酶N天然抑制劑，如Probestatin，Amastatin，Curcumin等；另外，人們還合成了許多小分子化合物氨肽酶N抑制劑，如α-氨基磷

4、酸抑制劑，β-氨基硫醇類抑制劑等。本課題組以氨肽酶N為靶點，經(jīng)十幾年的研究亦報道了許多小分子類肽化合物。 本研究以氨肽酶N為靶點在充分調(diào)研文獻的基礎(chǔ)上，基于E-Coli氨肽酶N（eAPN）的三維晶體結(jié)構(gòu)及bestatin與eAPN作用模式，通過計算機輔助合理藥物設(shè)計，合成一系列小分子類肽化合物并對它們進行初步的活性篩選，以期找到具有良好的氨肽酶N抑制活性的先導(dǎo)化合物。 實驗方法: 目前為止人氨肽酶N的晶體結(jié)構(gòu)尚未

5、報道，2006年大腸桿菌氨肽酶N的晶體結(jié)構(gòu)以及其與bestatin復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)陸續(xù)被報道。eAPN的晶體結(jié)構(gòu)表明氨肽酶N活性區(qū)域至少包含有一個陰離子結(jié)合位點和三個疏水性口袋，即：位于鋅離子左側(cè)的S1和右側(cè)的S1'和S2'口袋。本研究以bestatin作為先導(dǎo)物，充分利用計算機輔助藥物設(shè)計軟件的優(yōu)勢，構(gòu)建了一系列小分子化合物庫，并對所建立的小分子化合物庫進行虛擬篩選，尋找到與eAPN活性中心區(qū)域匹配良好的1，2-二氨基-3-苯丙烷骨架

6、。利用計算機軟件Syby1將該骨架和bestatin的母核AHPA進行比對，發(fā)現(xiàn)二者與eAPN的活性中心作用模式相似，并且二者的溶劑可及化表面也極為相似。在構(gòu)建的母核1，2-二氨基-3-苯丙烷結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，然后將不同的結(jié)構(gòu)片段與之拼接后再利用柔性對接模擬目標(biāo)化合物與靶酶的作用模式，依此對1，2-二氨基-3-苯丙烷骨架的側(cè)鏈進行結(jié)構(gòu)修飾，合理設(shè)計目標(biāo)化合物。 本研究以D-苯丙氨酸作為起始原料，經(jīng)甲酯化、甲磺?；?、疊氮化及還原反應(yīng)得到

7、關(guān)鍵中間體（2R）-2-叔丁氧羰酰胺基-3-苯基-丙胺，再利用經(jīng)典的二肽縮合反應(yīng)，將不同的結(jié)構(gòu)片段與之相拼接得到一系列二肽類化合物。第二系列類三肽化合物是在第一系列類二肽化合物基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化而來，將已制備的不同的二肽與（2R）-2-叔丁氧羰酰胺基-3-苯基-丙胺進行縮合反應(yīng)，再將保護基團脫去得到一系列類三肽目標(biāo)化合物。此外，本研究將目標(biāo)化合物進行了體外抑酶實驗、體外HL-60細(xì)胞生長測試實驗，篩選有氨肽酶N抑制活性的化合物。

8、 實驗結(jié)果: 本文共設(shè)計并合成了79個目標(biāo)化合物，并對所有化合物通過紅外光譜、核磁共振氫譜、電噴霧質(zhì)譜等方法進行了結(jié)構(gòu)確證。經(jīng)查閱文獻證實，所合成的目標(biāo)化合物為新型化合物，未見文獻報道。 本研究第一系列合成了38個以1，2-二氨基-3-苯丙烷為骨架結(jié)構(gòu)的類二肽化合物，體外抑酶實驗顯示大部分化合物對氨肽酶N具有一定的抑制活性，化合物11j，11k，11p，21顯示了良好的酶活性，但抑酶效果和對照物bestatin有一定的差

9、距。分析化合物11j，11k，11p結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，化合物末端的極性基團（如羥基，巰基，氨基等）可以提高化合物的氨肽酶N抑制活性；另外，化合物21作為本系列中的一個類三肽化合物，顯示了不錯的抑制活性，推測與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。在第一系列化合物活性結(jié)果基礎(chǔ)上，我們以第一系列中11p和21作為先導(dǎo)物，對其進行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，設(shè)計并合成了41個類三肽化合物，體外抑酶實驗顯示本系列相比于第一系列化合物，活性有明顯提高。從結(jié)構(gòu)上來講，第二系列類三肽化合物與

10、氨肽酶N的活性中心的作用優(yōu)于類二肽化合物，骨架的苯環(huán)可以伸入活性中心的S1疏水性口袋，而兩個側(cè)鏈R和R1分別伸向S1’和S2’口袋。其中化合物32d，44a，44d，44h的IC50在10μM以下，接近于對照物Bestatin（IC50：3.1±0.6μM）的氨肽酶N抑制活性。 體外細(xì)胞實驗通過MTT法測定了目標(biāo)化合物對白血病細(xì)胞HL-60的生長抑制作用，結(jié)果顯示對APN酶抑制作用強的化合物11p，21，32d，44a，44d和

11、44h同樣有很強的HL-60細(xì)胞抑制活性，化合物32d和44h的IC50分別為0.29±0.06mM和0.27±0.08mM，超過了bestatin。此外，基于氨肽酶N在腦啡肽降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，本文建立了兩套氨肽酶N抑制劑篩選體系用來更好的考察新型氨肽酶N抑制劑的活性。無論是豚鼠回腸平滑肌電針刺激實驗體系，還是HPLC檢測二肽Tyr-Gly在豚鼠腦蛋白中降解的實驗體系，都可以很好地用于評價氨肽酶N新型抑制劑的活性。 最后

12、，本文在1，2-二氨基-3-苯丙烷類氨肽酶N抑制劑活性結(jié)果基礎(chǔ)上，以所合成的化合物為對象，利用計算機軟件進行了初步的定量構(gòu)效關(guān)系研究。分子對接研究通過化合物44h的分子對接模式圖解析了本課題中氨肽酶N抑制劑與氨肽酶N活性中心的作用位點及作用模式。化合物44h的苯環(huán)，賴氨酸側(cè)鏈及巰基側(cè)鏈分別占據(jù)氨肽酶N活性區(qū)域的三個疏水性口袋S1，S1’和S2’，抑制劑與氨肽酶N活性中心區(qū)域匹配良好。采用比較分子場分析方法（CoMFA）建立了1，2-二氨

13、基-3-苯丙烷類氨肽酶N抑制劑的定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）模型。通過對CoMFA模型立體場等勢線圖和靜電場等勢線圖的分析，建立的CoMFA模型具有較高的交叉驗證系數(shù)q2和一定的預(yù)測能力。 研究結(jié)論: 本研究基于氨肽酶N的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑與酶的作用模式，利用計算機軟件進行設(shè)計并合成的1，2-二氨基-3-苯丙烷類化合物具有很好的氨肽酶N抑制活性。所設(shè)計的合成路線科學(xué)合理，原料經(jīng)濟易得。通過初步的活性測試發(fā)現(xiàn)了具有進一步研究價值