基于氯霉胺骨架的氨肽酶N抑制劑的設(shè)計、合成及其活性研究.pdf

1、研究背景:氨肽酶N(APN/CD13；EC3.4.11.2),是一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶,其廣泛存在于人的多種組織中,在不同細胞(上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和白細胞等)表面均有表達。相比于正常細胞,該酶在腫瘤細胞表面高水平表達,其在惡性腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及新血管的形成過程中扮演重要角色,成為研究抗癌藥物的一個重要靶點。
　　 目前,已有報道的天然抑制劑如:Bestatin,Probestatin,Amastatin,C

2、urcumin等在預(yù)防和治療腫瘤方面取得一定的積極效果。Bestatin作為第一個上市的APN抑制劑,臨床上已經(jīng)用于治療急性成年人非淋巴性白血病。另外,人們還合成了許多小分子APN抑制劑,如α-氨基磷酸類抑制劑,β-氨基硫醇類抑制劑,以及本課題組報道的環(huán)酰亞胺類抑制劑,L-賴氨酸衍生物抑制劑等。
　　 本研究以APN為靶點,設(shè)計合成了一系列小分子類肽化合物,并對其進行初步的生物活性篩選,以期發(fā)現(xiàn)具有良好APN抑制活性的抗癌先導(dǎo)化

3、合物。
　　 研究方法:在本實驗室前期研究工作中發(fā)現(xiàn)的活性先導(dǎo)物1,2-二氨基-3-苯丙烷結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,結(jié)合文獻調(diào)研,解析APN的三維晶體結(jié)構(gòu)及其與抑制劑的作用模式和特點,選擇了與該活性結(jié)構(gòu)相類似的氯霉胺為基本骨架,并在此基礎(chǔ)上選擇能與酶活性中心的疏水性口袋相互作用的不同側(cè)鏈與之拼合進行衍生化。結(jié)構(gòu)修飾主要考慮以下三個因素:1)引入不同體積和長度的疏水側(cè)鏈,考察立體效應(yīng)對酶的作用。2)側(cè)鏈中選擇不同的吸電子基和斥電子基,考察不同電

4、性效應(yīng)對酶的作用。3)側(cè)鏈中選擇可能與酶相互作用的氫鍵基團,以增強化合物與酶的親和力。本研究綜合利用計算機輔助藥物設(shè)計軟件的優(yōu)勢,對設(shè)計的化合物與酶進行柔性對接打分,選擇分值較高的化合物進行化學(xué)合成。同時,對其分子量、脂水分配系數(shù)、氫鍵受體和氫鍵供體數(shù)進行了預(yù)測,采用Lipinski規(guī)則進一步篩選,最終設(shè)計了三個系列115個全新結(jié)構(gòu)的目標化合物。目標化合物的合成以氯霉胺為起始原料,采用了氨基保護,選擇性氧化,溴代,疊氮化,還原,縮合等多

5、個反應(yīng)步驟完成,采用紅外光譜、核磁共振氫譜、電噴霧質(zhì)譜、X-ray單晶衍射等方法確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 生物活性研究選用體外抑酶(APN,MMP-2)活性試驗、腫瘤細胞(HL-60,ES-2,K549等)生長抑制試驗和小鼠體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移試驗對目標化合物進行了初步活性評價,從中篩選出具有較好活性的氯霉胺類APN抑制劑作為抗癌先導(dǎo)化合物。
　　 研究結(jié)果:本研究最終合成了115個目標化合物,其中大部分化合物產(chǎn)率較高,純度良好

6、,所有化合物進行了化學(xué)結(jié)構(gòu)確證。經(jīng)文獻檢索,所合成的目標化合物為新型結(jié)構(gòu),未見相關(guān)報道。
　　 本研究合成的78個A系列目標化合物中,大部分化合物對APN具有抑制活性,其中化合物9e(9e’),9m(9m’),9r(9r’)和9s(9s’)活性較好。B系列化合物相比于A系列化合物,整體上活性有明顯提高。其中,化合物12w,12x和12y的IC50在35μM以下,接近于陽性對照藥Bestatin的APN抑制活性。然而,B系列化合物

7、同樣也顯示出較強的MMP-2抑制活性。在C系列中,化合物16k,161與陽性對照藥Bestatin的活性相當,且對MMP-2的抑制活性較低,顯示了良好的抑酶選擇性。
　　 本研究在對上述目標化合物進行抑酶活性試驗的基礎(chǔ)上,利用計算機軟件進行了初步定量構(gòu)效關(guān)系研究。采用比較分子力場分析方法(CoMFA)建立了具有較高的交叉驗證系數(shù)q2和一定預(yù)測能力的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型。通過對CoMFA模型立體場等勢線圖和靜電場等勢線圖的

8、分析,提出了化合物下一輪結(jié)構(gòu)優(yōu)化的方案,為氯霉胺類APN抑制劑的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 體外細胞抑瘤實驗結(jié)果表明,多數(shù)化合物對高表達APN的腫瘤細胞顯示出良好的抑制效果。其中,化合物161、12w表現(xiàn)出與陽性對照藥相當?shù)哪[瘤細胞抑制活性。
　　 體內(nèi)小鼠抗腫瘤轉(zhuǎn)移試驗結(jié)果證明,化合物12w和161均有一定的抑制荷肝癌H22小鼠腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用。其中,化合物12w的抑制率為48.51％,小于陽性對照藥Bestati

9、n(抑制率為58.04％),161的抑制率達到了56.49％,接近陽性對照藥Bestatin。
　　 研究結(jié)論:本研究基于 APN的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑與酶的作用模式,借助計算機軟件進行合理藥物設(shè)計并合成的氯霉胺類化合物具有較好的APN抑制活性。所設(shè)計的合成路線科學(xué)合理,起始原料經(jīng)濟易得。通過初步的活性測試發(fā)現(xiàn)了具有進一步研究價值的活性化合物。其中,化合物12w,161可以作為抗癌先導(dǎo)化合物用于下一輪的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。同時,基于化合物結(jié)構(gòu)