金黃色葡萄球菌腸毒素E的克隆表達和生物活性研究以及基因組DNA固定化研究.pdf

1、1989年，瑞典科學家White J提出超抗原的概念，它是一類由細菌、病毒、寄生蟲產生的對淋巴細胞具有強大刺激功能的蛋白質，由于其對T淋巴細胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故稱為超抗原。金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是目前全世界范圍內廣泛研究的一種典型的超抗原。 與普通抗原不同，腸毒素超抗原首先以完整分子結合于抗原提呈細胞(APc)表面的II類主要組織相容性

2、復合體(MHC)的抗原結合溝槽外側，而后與T細胞表面的抗原受體分子(TCR)的Vβ區(qū)結合，形成SE-MHC-TCR三分子復合物后大量激活T細胞。由此激活的T細胞可直接殺傷表達MHC-II類分子的腫瘤細胞，而對不表達MHC-II類分子的腫瘤細胞也可產生間接的殺傷效應。 目前已發(fā)現(xiàn)的SEs約有20余種，包括：SEA～SEE、SEG～SEQ及TSST-l等。其中研究最為深入的主要包括A型金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococca

3、lenterotoxinA，SEA)、B型金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin B，SEB)、C2型金黃色萄萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin C2，SEC2)等，而對其它分型的腸毒素研究較少。E型金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxin E，SEE)作為一新型腸毒素，具有較好的熱穩(wěn)定性和較低的免疫原性，存在進行進一步研究的價值。

4、 為了獲得高純度的SEE蛋白，研究其抗腫瘤活性，本研究試圖通過基因工程手段大量表達重組蛋白。從天然產SEE的S.aureus (FRI 326)中擴增得到see基因，克隆至E. coli中大量表達重組SEE(recombinant SEE，rSEE)，通過親和層析和陰離子交換層析得到純度高于85％的rSEE，該重組蛋白僅在N端比nsEE多兩個氨基酸殘基(亮氨酸-谷氨酸，LeuGlu)。MTT法分析rSEE對T淋巴細胞的增殖作用和體外抗

5、腫瘤效果，結果表明rSEE具有典型的超抗原活性。具超抗原活性的高純度rSEE，為進一步研究該蛋白的抗腫瘤機制，構建靶向抗腫瘤融合蛋白奠定了基礎。 本課題運用基因工程手段獲得了純度為85％的重組腸毒素rSEE，為制備該蛋白的單克隆和多克隆抗體奠定了基礎;MTT法結果表明rSEE具有典型的超抗原活性：低濃度下引起T細胞大量增殖，通過激活T細胞產生顯著的體外抗腫瘤效果，為深入研究SEE抗腫瘤原理，靶向抗腫瘤融合蛋白的構建以及腸毒素系列

6、蛋白的平行比較研究打下物質基礎。 在本次研究中，我們使用了水凝膠作為固相支持載體，選擇了合適的化學固定方法，首次實現(xiàn)了對人基因組DNA的固定和反復使用。首先我們將末端修飾的PCR產物固定到凝膠上，檢測了該法的固定效率以及熱穩(wěn)定性。通過改變反應條件，我們嘗試用這一策略固定質粒碎片以及基因組DNA碎片，并作為模板DNA用于隨后的PCR擴增反應中。該法固定DNA的效率高，熱穩(wěn)定性好，固定特異性高，同時固定載體具有良好的親水性，便于隨后