食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因在液體培養(yǎng)基和牛肉制品中的表達(dá)研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡(jiǎn)稱金葡菌)廣泛存在于自然環(huán)境中，可通過(guò)多種渠道污染食品，是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一。目前在全球范圍內(nèi)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中均占有較大比例。金葡菌能夠分泌多種致病性物質(zhì)，其中腸毒素是金葡菌導(dǎo)致食物中毒和過(guò)敏性休克的關(guān)鍵毒力因子。目前研究確定的SE共有11種，分別是SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SER、SES和S

2、ET。但是國(guó)內(nèi)外有關(guān)SE分布及表達(dá)的研究所用菌株大多來(lái)源于臨床病例，對(duì)食品安全方面的意義不大，此外，國(guó)內(nèi)外有關(guān)腸毒素在食品中表達(dá)規(guī)律研究甚少。因此，本試驗(yàn)研究腸毒素基因在食品中的分布及其在液體培養(yǎng)基和五香牛肉中的相對(duì)表達(dá)水平，揭示其時(shí)序性表達(dá)規(guī)律，同時(shí)為預(yù)防和控制金葡菌中腸毒素的表達(dá)提供一定的基礎(chǔ)和支撐。
　　1.金黃色葡萄球菌的分離鑒定及在食品中的分布研究
　　本試驗(yàn)旨在研究食源性金黃色葡萄球菌各血清型腸毒素基因的分布。采

3、用微生物傳統(tǒng)檢測(cè)方法和PCR擴(kuò)增方法，對(duì)收集的2514份樣品（肉制品486份，豆制品350份，乳制品384份，水產(chǎn)品446份，牛乳480份，生鮮肉368份）進(jìn)行檢測(cè)，共分離金黃色葡萄球菌51株，金黃色葡萄球菌在肉制品中的檢出率最高3.91％。
　　本研究以16sRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用雙重PCR方法鑒定各腸毒素的基因型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除ses、set和see外，在51株食源性金黃色葡萄球菌菌株中其余8種腸毒素基因均有檢出，陽(yáng)性率達(dá)43

4、.14％，其中，sei和seg的陽(yáng)性率(27.45％)顯著高于其它血清型;傳統(tǒng)的5種腸毒素血清型中以sed(13.73％)檢出率最高。
　　2.金黃色葡萄球菌腸毒素基因在液體培養(yǎng)基中的時(shí)序性表達(dá)分析
　　本試驗(yàn)旨在研究各腸毒素在液體培養(yǎng)基中的時(shí)序性表達(dá)規(guī)律。通過(guò)檢測(cè)不同生長(zhǎng)時(shí)期菌體OD600吸光度值，繪制金葡菌的生長(zhǎng)曲線，分別在達(dá)到各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期所對(duì)應(yīng)的吸光值時(shí)立即收集菌體提取細(xì)菌總RNA，以ftsZ和ropB作為內(nèi)標(biāo)基因，采

5、用改良的ΔΔCt法進(jìn)行定量分析，利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)，研究各腸毒素基因在液體培養(yǎng)基中不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各腸毒素基因在mRNA水平的時(shí)序性表達(dá)規(guī)律基本一致:均在對(duì)數(shù)后期達(dá)到峰值，隨后快速下降。以內(nèi)標(biāo)基因?yàn)閰⒄眨痪曛胁煌c毒素基因的相對(duì)表達(dá)量以及不同菌株中同一腸毒素基因的相對(duì)表達(dá)量均差異較大。
　　3.金黃色葡萄球菌典型腸毒素在牛肉制品中的表達(dá)水平研究
　　由于目前國(guó)際上缺乏腸毒素在食品中表達(dá)情

6、況研究，本試驗(yàn)旨在研究腸毒素sea-sed在中國(guó)傳統(tǒng)五香牛肉中的表達(dá)規(guī)律。本試驗(yàn)對(duì)采取中國(guó)傳統(tǒng)五香牛肉加工工藝生產(chǎn)的牛肉，人工污染分別攜帶有腸毒素sea、seb、sec、sed的金葡菌約104CFU/g，在23℃恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)第1、2、3、5、7d取樣，將個(gè)樣品分別進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)、毒素基因反轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析和毒素檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1-2d細(xì)菌數(shù)即可達(dá)到最大值;在傳統(tǒng)牛肉培養(yǎng)過(guò)程中，sea-sed的mRNA均有檢出，且峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第1