食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因在液體培養(yǎng)基和牛肉制品中的表達研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡稱金葡菌)廣泛存在于自然環(huán)境中，可通過多種渠道污染食品，是引起細菌性食物中毒的重要病原菌之一。目前在全球范圍內(nèi)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒中均占有較大比例。金葡菌能夠分泌多種致病性物質(zhì)，其中腸毒素是金葡菌導致食物中毒和過敏性休克的關(guān)鍵毒力因子。目前研究確定的SE共有11種，分別是SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SER、SES和S

2、ET。但是國內(nèi)外有關(guān)SE分布及表達的研究所用菌株大多來源于臨床病例，對食品安全方面的意義不大，此外，國內(nèi)外有關(guān)腸毒素在食品中表達規(guī)律研究甚少。因此，本試驗研究腸毒素基因在食品中的分布及其在液體培養(yǎng)基和五香牛肉中的相對表達水平，揭示其時序性表達規(guī)律，同時為預防和控制金葡菌中腸毒素的表達提供一定的基礎(chǔ)和支撐。
　　1.金黃色葡萄球菌的分離鑒定及在食品中的分布研究
　　本試驗旨在研究食源性金黃色葡萄球菌各血清型腸毒素基因的分布。采

3、用微生物傳統(tǒng)檢測方法和PCR擴增方法，對收集的2514份樣品（肉制品486份，豆制品350份，乳制品384份，水產(chǎn)品446份，牛乳480份，生鮮肉368份）進行檢測，共分離金黃色葡萄球菌51株，金黃色葡萄球菌在肉制品中的檢出率最高3.91％。
　　本研究以16sRNA基因為內(nèi)參基因，采用雙重PCR方法鑒定各腸毒素的基因型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除ses、set和see外，在51株食源性金黃色葡萄球菌菌株中其余8種腸毒素基因均有檢出，陽性率達43

4、.14％，其中，sei和seg的陽性率(27.45％)顯著高于其它血清型;傳統(tǒng)的5種腸毒素血清型中以sed(13.73％)檢出率最高。
　　2.金黃色葡萄球菌腸毒素基因在液體培養(yǎng)基中的時序性表達分析
　　本試驗旨在研究各腸毒素在液體培養(yǎng)基中的時序性表達規(guī)律。通過檢測不同生長時期菌體OD600吸光度值，繪制金葡菌的生長曲線，分別在達到各個生長時期所對應(yīng)的吸光值時立即收集菌體提取細菌總RNA，以ftsZ和ropB作為內(nèi)標基因，采

5、用改良的ΔΔCt法進行定量分析，利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)，研究各腸毒素基因在液體培養(yǎng)基中不同生長時期的表達水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各腸毒素基因在mRNA水平的時序性表達規(guī)律基本一致:均在對數(shù)后期達到峰值，隨后快速下降。以內(nèi)標基因為參照，同一菌株中不同腸毒素基因的相對表達量以及不同菌株中同一腸毒素基因的相對表達量均差異較大。
　　3.金黃色葡萄球菌典型腸毒素在牛肉制品中的表達水平研究
　　由于目前國際上缺乏腸毒素在食品中表達情

6、況研究，本試驗旨在研究腸毒素sea-sed在中國傳統(tǒng)五香牛肉中的表達規(guī)律。本試驗對采取中國傳統(tǒng)五香牛肉加工工藝生產(chǎn)的牛肉，人工污染分別攜帶有腸毒素sea、seb、sec、sed的金葡菌約104CFU/g，在23℃恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)第1、2、3、5、7d取樣，將個樣品分別進行細菌計數(shù)、毒素基因反轉(zhuǎn)錄表達分析和毒素檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1-2d細菌數(shù)即可達到最大值;在傳統(tǒng)牛肉培養(yǎng)過程中，sea-sed的mRNA均有檢出，且峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第1