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文檔簡介
1、目的: 蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾,它參與和調(diào)控生物體的許多生命活動。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,蛋白質(zhì)糖基化研究越來越受到廣泛的重視。 CD147是高度糖基化的跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族的成員。CD147是細(xì)胞表面多功能糖蛋白,廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞中,如淋巴母細(xì)胞,炎癥細(xì)胞,特別在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)。CD147主要通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶活性參與組織重構(gòu),參與許多生理和病理過程,包括精子發(fā)生、受精、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成
2、和發(fā)育、HIV感染和腫瘤轉(zhuǎn)移。 CD147由2個胞外Ig結(jié)構(gòu)域,1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。從CD147N端起,第一個胞外Ig結(jié)構(gòu)域與MMPs誘導(dǎo)活性及CD147自身寡聚有關(guān);第二個胞外Ig結(jié)構(gòu)域與窖蛋白(Caveolin-1,Cav-1)存在相互作用。由于N-糖基化不同,CD147同時表現(xiàn)為高糖型CD147(HG-CD147,分子量40-66kDa)和低糖型CD147(LG-CD147,分子量32kDa)。有文獻(xiàn)報道,
3、N-糖基化對CD147的誘導(dǎo)活性起促進(jìn)作用,但CD147糖基化的功能尚有待深入研究。 本文基于本實驗室已構(gòu)建的野生型CD147真核表達(dá)載體,利用快速PCR定點突變的方法,構(gòu)建CD147糖基化位點突變的真核表達(dá)載體,并將其穩(wěn)定表達(dá)于小鼠肝正常細(xì)胞IAR20中,觀察CD147的糖基化對細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。 方法: 1.利用快速PCR定點突變的方法,構(gòu)建CD147糖基化位點突變pcDNA3.1表達(dá)載體。 2
4、.利用脂質(zhì)體將野生型CD147及其糖基化位點突變體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至小鼠肝正常細(xì)胞IAR20細(xì)胞上,以空表達(dá)載體做對照,經(jīng)G418篩選及RT-PCR和Western blot分析,獲得野生型CD147及其糖基化位點突變體穩(wěn)定表達(dá)株。 3.利用MTT法檢測穩(wěn)定表達(dá)野生型CD147及其糖基化位點突變體對IAR20細(xì)胞增殖能力的影響;利用體外基質(zhì)侵襲實驗,觀察檢測穩(wěn)定表達(dá)野生型CD147及其糖基化位點突變體對IAR20細(xì)胞遷移和侵襲能力的
5、影響。 結(jié)果: 1、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序鑒定表明,成功構(gòu)建小鼠CD147糖基化位點突變真核表達(dá)載體pcDNA3.1/CD147 (N154Q)和pcDNA3.1/CD147 (N44,154Q)。 2、Western blot和RT-PCR結(jié)果表明,pcDNA3.1/CD147WT,pcDNA3.1/CD147N154Q和pcDNA3.1/CD147N44,190Q在小鼠肝正常細(xì)胞IAR20細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)
6、野生型CD147和糖基化位點突變體CD147N154Q的分子量分別為44kDa和45kDa,糖基化位點突變體CD147N44,190Q表達(dá)為兩條帶,分子量分別為37kDa和42kDa。 3、與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,穩(wěn)定表達(dá)野生型CD147和糖基化位點突變體CD147N154Q的IAR20細(xì)胞增殖能力和遷移能力顯著增強(qiáng)(p<0.05),而穩(wěn)定表達(dá)糖基化位點突變體CD147(N44,190Q)對IAR20細(xì)胞的增殖能力和遷移能
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