糖基化CD147調(diào)節(jié)心肌膠原交聯(lián)度的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　高血壓是心血管病(cardiovascular disease,CVD)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,它導(dǎo)致的心肌肥大并最終轉(zhuǎn)化為心力衰竭嚴(yán)重制約了CVD的臨床防治效果。心肌膠原交聯(lián)度降低是誘導(dǎo)心肌肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素,然而對(duì)于間質(zhì)纖維化程度不斷增高的肥大心肌,其膠原交聯(lián)度的變化存在諸多爭(zhēng)議,且心肌膠原交聯(lián)度降低的機(jī)制更不是十分清楚。CD147是免疫球蛋白超家族的成員之一,其糖基化程度增加時(shí),可激活基質(zhì)金屬蛋白酶(

2、matrix metalloproteinase,MMP),進(jìn)而影響膠原交聯(lián)度。研究表明,CD147與心肌缺血-再灌注損傷、鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄、心力衰竭等多種CVD相關(guān),且血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞的CD147表達(dá)上調(diào)、糖基化程度增強(qiáng)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用腎性高血壓誘導(dǎo)心肌肥大,證實(shí)糖基化CD147是調(diào)節(jié)心肌膠原交聯(lián)度的關(guān)鍵因素,并闡明其可能機(jī)制;同時(shí),揭示心肌局部Ang II對(duì)CD147的

3、表達(dá)量與糖基化程度的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　【目的】
　　借助腎性高血壓引起的慢性壓力超負(fù)荷與Ang II含量增加誘導(dǎo)的心肌肥大大鼠模型,闡明心肌局部高濃度的Ang II導(dǎo)致CD147的表達(dá)與糖基化程度增加,進(jìn)而激活MMP,促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化,同時(shí)降低心肌膠原交聯(lián)度的機(jī)制。有望為臨床防治高血壓導(dǎo)致的心肌肥大向心力衰竭的轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)與干預(yù)新靶點(diǎn)。
　　【方法】
　　首先,本實(shí)驗(yàn)采用Goldblatt兩腎一夾(two-k

4、idney one-clip,2K1C)大鼠模型模擬腎性高血壓導(dǎo)致的心肌肥大,通過(guò)生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)影像學(xué)等多重指標(biāo)對(duì)2K1C大鼠進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估,運(yùn)用Western blot與植物凝血素植物血球凝集素-L(phytohemagglutinin-L,PHA-L)染色檢測(cè)肥大心肌不同時(shí)期 CD147的表達(dá)與糖基化水平。
　　然后,給予模型動(dòng)物 CD147的糖基化酶β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V(β1,6-N

5、-acetylglucosaminyl transferase-V,GnT-V)的抑制劑衣霉素或活化劑維甲酸,運(yùn)用Western blot、免疫熒光組織化學(xué)與植物凝血素PHA-L染色檢測(cè)心肌CD147的表達(dá)與糖基化水平,采用明膠酶譜測(cè)定MMP-2和-9的活性,Masson染色及羥基脯氨酸含量測(cè)定觀察心肌間質(zhì)纖維化程度與膠原含量,并檢測(cè)心肌膠原交聯(lián)度的變化。
　　最后,給予模型動(dòng)物1型血管緊張素受體(angiotensin rece

6、ptor type1,AT1)拮抗劑氯沙坦,依然檢測(cè)心肌CD147的表達(dá)與糖基化水平。進(jìn)一步分離并培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat cardiomyocyte,NRCM),Ang II、氯沙坦、2型血管緊張素受體(angiotensin receptor type2,AT2)拮抗劑PD123319、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制劑十字孢堿、PKC活化劑12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽（phorb

7、ol12-myristate13-acetate,PMA)、衣霉素或維甲酸處理后,檢測(cè)NRCM CD147的表達(dá)與糖基化水平。
　　【結(jié)果】
　　(1)2K1C大鼠心肌CD147表達(dá)與糖基化進(jìn)行性升高
　　2K1C大鼠的心臟結(jié)構(gòu)與功能呈現(xiàn)時(shí)間依賴性改變。頸動(dòng)脈插管測(cè)量血壓顯示,2K1C大鼠血壓呈進(jìn)行性升高,術(shù)后1 w血壓即明顯升高,8 w時(shí)收縮壓(systolic blood preasure,SBP)已經(jīng)超過(guò)200

8、mmHg。ELISA結(jié)果提示,2K1C大鼠血漿Ang II濃度在術(shù)后1 w即達(dá)到峰值,并維持在較高水平;同樣,心肌Ang II濃度在達(dá)到峰值后始終維持在較高水平。在系統(tǒng)性評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)與功能時(shí)選用了多重指標(biāo)進(jìn)行全面分析。首先,運(yùn)用ELISA檢測(cè)心肌肥大標(biāo)志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),結(jié)果表明,2K1C大鼠術(shù)后心肌組織ANP濃度始終維持在較高水平。其次,由大體觀察與心臟四腔切面可見(jiàn),2K1C

9、大鼠術(shù)后4 w開(kāi)始出現(xiàn)心臟增大、室間隔和心室壁明顯增厚、心腔縮小等特征,且生物學(xué)測(cè)量進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。另外,左心室、右心室的心室重量/心臟重量(ventricle weight/heart weight,VW/HW)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不僅如此,組織病理學(xué)檢查提示,2K1C大鼠4 w后心肌纖維增粗,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示單個(gè)心肌細(xì)胞直徑明顯增大。再次,超聲心動(dòng)圖檢查提示,表征心臟舒張功能的左心室縮短率(fractional shortening,

10、FS)和收縮功能的左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)稍有降低,但并未達(dá)到心力衰竭的標(biāo)準(zhǔn)。與此同時(shí),2K1C大鼠與Sham大鼠的肺臟重量/體重(lung weight/body weight,LungW/BW)、肝臟重量/體重(liver weight/body weight,LiverW/BW)、肺臟與肝臟干重/濕重(dry weight/wet weight,Wd/Ww)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。最后,Masson染色及

11、羥基脯氨酸含量測(cè)定表明,與Sham大鼠相比,2K1C大鼠心肌間質(zhì)纖維化逐漸增強(qiáng),心肌膠原含量呈進(jìn)行性增加。另外,大體觀察及生物學(xué)測(cè)量顯示,2K1C導(dǎo)致腎動(dòng)脈縮窄側(cè)腎臟術(shù)后體積與重量逐漸減小,左腎重量/右腎重量(left kidney weight/right kidney weight,LKW/RKW)逐漸降低,即2K1C導(dǎo)致腎動(dòng)脈縮窄側(cè)腎臟術(shù)后逐漸萎縮,這也是2K1C模型的標(biāo)準(zhǔn)之一。
　　2K1C大鼠心肌 CD147的表達(dá)量進(jìn)行

12、性升高,其糖基化水平也逐漸增強(qiáng)。由于2K1C大鼠血壓、心肌肥大程度、間質(zhì)纖維化水平及 CD147表達(dá)量均呈現(xiàn)進(jìn)行性改變趨勢(shì),因此采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估CD147表達(dá)量與血壓、心肌肥大及間質(zhì)纖維化程度之間的關(guān)系。結(jié)果表明,CD147表達(dá)水平與血壓、心肌肥大及間質(zhì)纖維化程度均呈正相關(guān)。而進(jìn)一步的受試者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)分析則證實(shí)了CD147表達(dá)量可能具備一定的診斷能力

13、。ROC分析顯示,CD147表達(dá)量能夠診斷高血壓、心肌肥大及間質(zhì)纖維化。
　　(2)糖基化CD147參與調(diào)節(jié)心肌膠原交聯(lián)度
　　從整體來(lái)看,本實(shí)驗(yàn)中使用的GnT-V抑制劑衣霉素或活化劑維甲酸對(duì)2K1C大鼠的血壓和心肌組織Ang II濃度并無(wú)明顯影響。對(duì)心臟而言,衣霉素或維甲酸處理的Sham大鼠的心臟大小并無(wú)明顯改變,但衣霉素處理的2K1C大鼠心臟縮小,而維甲酸處理的心臟增大。進(jìn)一步的生物學(xué)測(cè)量表明,由于衣霉素明顯降低大鼠BW

14、,衣霉素處理的Sham與2K1C大鼠心臟重量/體重(heart weight/body weight,HW/BW)顯著升高,且高于相應(yīng)的Sham或2K1C大鼠,造成心肌肥大的假象。超聲心動(dòng)圖檢查提示,維甲酸降低2K1C大鼠的左心室EF值。Western blot結(jié)果顯示,衣霉素使2K1C大鼠心肌 CD147表達(dá)降低,而維甲酸則使其增加。同樣,免疫熒光組織化學(xué)染色顯示,衣霉素使2K1C大鼠心肌CD147在心肌細(xì)胞膜上的分布減少,而維甲酸則

15、使其增加。進(jìn)一步的植物凝集素PHA-L染色提示,衣霉素使Sham及2K1C大鼠心肌糖基化程度減弱,而維甲酸使其糖基化程度增強(qiáng)。于是,我們進(jìn)一步檢測(cè)心肌膠原交聯(lián)度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),衣霉素對(duì)2K1C大鼠心肌膠原交聯(lián)度并無(wú)明顯影響,而維甲酸則使其下降。
　　明膠酶譜結(jié)果顯示,2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活性增強(qiáng),給予衣霉素后,2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活性均下降,相反,給予維甲酸時(shí),Sham與2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活

16、性升高。
　　(3)Ang II經(jīng)AT1、PKC、GnT-V促進(jìn)CD147糖基化
　　給予氯沙坦后,血壓測(cè)量、ELISA、大體觀察與生物測(cè)量提示,氯沙坦能有效降低2K1C大鼠的血壓、延緩心肌肥大。Western blot與免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示,氯沙坦可降低2K1C大鼠心肌CD147的表達(dá),進(jìn)一步的植物凝集素PHA-L染色提示,給予氯沙坦能夠減弱2K1C大鼠心肌細(xì)胞膜上的糖基化程度。離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AT1拮抗劑氯沙坦、P

17、KC抑制劑十字孢堿、GnT-V抑制劑衣霉素可降低Ang II處理的NRCM CD147的表達(dá)水平及糖基化程度,AT2拮抗劑PD123319對(duì)兩者均無(wú)影響,而PKC活化劑PMA與GnT-V活化劑維甲酸可增加NRCM CD147的表達(dá)水平及糖基化程度。
　　【結(jié)論】
　　本實(shí)驗(yàn)初步闡釋了糖基化 CD147參與調(diào)節(jié)心肌膠原交聯(lián)度,其可能的機(jī)制是Ang II誘導(dǎo)CD147表達(dá)與糖基化程度增加,進(jìn)而激活MMP,促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化,同時(shí)