CD59基因W40位點(diǎn)突變、真核表達(dá)與生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:采用基因點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建兩種CD59突變基因并重組入真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立高效真核表達(dá)系統(tǒng)，觀測(cè)細(xì)胞表面野生型CD59與突變型CD59分子的表達(dá)情況，探討CD59抗補(bǔ)體活性變化，推斷W40位點(diǎn)及鄰近氨基酸的生物學(xué)活性，以初步揭示CD59分子在腫瘤逃逸中的作用，為腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。 方法:選取物種問(wèn)高度保守W40位點(diǎn)基因及相鄰堿基為突變位點(diǎn)，構(gòu)建兩種不同的基因突變，一種是編碼W40的密碼子TGG缺失突變(M1

2、)，另一種是C39W40K41→W39W40W41的相應(yīng)基因突變(M2)，采用Overlap extension PCR法誘導(dǎo)CD59點(diǎn)突變，各設(shè)計(jì)兩條常規(guī)引物和兩條反向互補(bǔ)突變引物，以己構(gòu)建CD59cDNA為模板，3重PCR定點(diǎn)誘變擴(kuò)增突變基因，重組入克隆載體PMDl8-T-Vector,EcoRⅠ單酶切后，突變基因重組入真核表達(dá)載體pIRES。利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lipfectamine2000)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chi

3、nese hamster ovary,CHO)進(jìn)行表達(dá)。G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，核酸原位雜交檢測(cè)CD59mRNA的表達(dá)，熒光免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)篩選CD59突變基因蛋白高表達(dá)株，染料釋放試驗(yàn)與臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)檢測(cè)和比較野生型與突變型CD59蛋白抗補(bǔ)體活性的不同。 結(jié)果:通過(guò)PCR定點(diǎn)誘變成功獲得目的CD59突變基因，序列測(cè)定及酶切鑒定均證實(shí)成功構(gòu)建了pIRES-M1CD59、pIRES-

4、M2CD59重組真核表達(dá)載體系統(tǒng)，突變基因長(zhǎng)度約500bp。核酸原位雜交顯示CD59mRNA的表達(dá)，免疫熒光、ELISA、Western-blot驗(yàn)證CD59的表達(dá)，傳代30代，仍可測(cè)到蛋白表達(dá)；熒光染料釋放試驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)研究顯示與野生型CD59相比，突變型M1CD59失去對(duì)補(bǔ)體的抑制功能，而突變型M2CD59對(duì)補(bǔ)體的抑制作用較強(qiáng)。 結(jié)論： 1.采用基因點(diǎn)突變和基因重組技術(shù)成功構(gòu)建兩種突變CD59重組質(zhì)粒。