大鼠糖皮質激素受體基因腺病毒載體的構建及其在腎系膜細胞中的表達.pdf

1、目的：利用AdEasy系統(tǒng)構建大鼠糖皮質激素受體(GR)基因重組腺病毒載體，轉染大鼠系膜細胞，并通過Western Blot方法檢測GR蛋白的表達． 方法：將質粒pcDNA1．Neo-Rat GR擴增、膠回收獲得的Rat GR cDNA雙酶切片段插入腺病毒穿梭載體質粒pShuttle-CMV的巨細胞病毒(cMV)啟動子下游，構建重組穿梭載體pShuttle-CMV-Rat GR，線性化后與骨架載體AdEasy-1在細菌BJ518

2、3內經同源重組得到腺病毒重組質粒pAd-Rat GR，經人胚腎293細胞包裝后得到復制缺陷型重組腺病毒Ad-Rat GR；用包裝后的病毒上清轉染大鼠腎系膜細胞，提取細胞中的總蛋白，通過Western Blot方法檢測GR蛋白的表達。 結果：連接、重組后通過酶切和測序法篩選出pAd-Rat GR重組質粒，；經人胚腎293細胞包裝，48小時后觀察到增強型綠色熒光蛋白(EGFP)明顯表達，氯化銫梯度離心純化最終獲得1×10<'9>PF