表達cdk5-siRNA重組腺相關病毒載體的構建及CDK在NPC神經(jīng)變性中的作用.pdf

1、第一部分 不同年齡階段npc小鼠神經(jīng)元細胞骨架損害的動態(tài)觀察 目的 了解npc小鼠不同年齡階段cdk活化所導致的神經(jīng)元細胞骨架損害的程度。以便進一步探索NPC的發(fā)病機制和新的治療策略。 方法 在小鼠出生后的1、2、3、4和5周處死所有同齡的小鼠，然后采用PCR的方法鑒定基因型，保留npc-/-小鼠和相應數(shù)量的同齡野生型小鼠(每年齡組至少4只)的腦組織做免疫組織化學染色，觀察cdk活化所致的球狀神經(jīng)

2、軸突出現(xiàn)的時間和數(shù)目。 結果 在3周npc小腦即可檢測到cdk的異?；罨鸬那驙钌窠?jīng)軸突，且在小腦較腦干出現(xiàn)早、數(shù)量更多。球狀神經(jīng)軸突數(shù)目隨著小鼠的年齡增大越來越多。 結論 ①npc小鼠自3周齡開始出現(xiàn)神經(jīng)元細胞骨架損害及cdk激活；②病變的嚴重程度隨年齡增長而增加。 第二部分利用Helper-Free系統(tǒng)構建cdk5-siRNA腺相關病毒載體并鑒定 目的 構建能表達cdk5特

3、異性siRNA(cdk5-siRNA)的Ⅱ型重組腺相關病毒載體，體外觀察其對cdk5基因的特異性沉默作用。 方法 設計一段在體內能轉錄出特異性cdk5-siRNA的寡核苷酸序列，人工合成該序列后采用基因克隆技術，將其克隆至通用RNAi表達質粒pSilencer-U6中，構建出質粒pSilencer-U6-cdk5-siRNA。同時將EGFP連入表達質粒pAAV-MCS，得到質粒pAAV-MCS-EGFP。然后通過PCR從

4、pSilencer-U6-cdk5-siRNA中擴增出U6-cdk5-siRNA片段，并將其克隆至pAAV-MCS-EGFP，構建出表達質粒pAAV-MCS-EGFP-cdk5-siRNA-U6。重組質粒通過酶切，測序鑒定后與該系統(tǒng)中的控制質粒pAAV-RC、輔助質粒pHelper用磷酸鈣法共轉染HEK293細胞，包裝得到表達cdk5-siRNA的Ⅱ型重組腺相關病毒載體(rAAV2-cdk5-siRNA)。重組病毒純化后通過斑點雜交法測

5、定滴度，病毒感染體外培養(yǎng)的PC12細胞，Westernblot檢測其抑制cdk5表達的特異性和效果。 結果 各質粒構建正確，成功包裝出重組腺相關病毒載體rAAV2-cdk5-siRNA，病毒滴度達2×1012v.g/ml，重組病毒能感染體外培養(yǎng)的PC12細胞，并能明顯而特異性下調cdk5的表達。 結論 構建的重組腺相關病毒載體rAAV2-cdk5-siRNA能明顯干擾細胞內cdk5的表達，為進一步探索cd