表達(dá)cdk5-siRNA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及CDK在NPC神經(jīng)變性中的作用.pdf

1、第一部分 不同年齡階段npc小鼠神經(jīng)元細(xì)胞骨架損害的動(dòng)態(tài)觀察 目的 了解npc小鼠不同年齡階段cdk活化所導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞骨架損害的程度。以便進(jìn)一步探索NPC的發(fā)病機(jī)制和新的治療策略。 方法 在小鼠出生后的1、2、3、4和5周處死所有同齡的小鼠，然后采用PCR的方法鑒定基因型，保留npc-/-小鼠和相應(yīng)數(shù)量的同齡野生型小鼠(每年齡組至少4只)的腦組織做免疫組織化學(xué)染色，觀察cdk活化所致的球狀神經(jīng)

2、軸突出現(xiàn)的時(shí)間和數(shù)目。 結(jié)果 在3周npc小腦即可檢測(cè)到cdk的異常活化所引起的球狀神經(jīng)軸突，且在小腦較腦干出現(xiàn)早、數(shù)量更多。球狀神經(jīng)軸突數(shù)目隨著小鼠的年齡增大越來(lái)越多。 結(jié)論 ①npc小鼠自3周齡開始出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞骨架損害及cdk激活；②病變的嚴(yán)重程度隨年齡增長(zhǎng)而增加。 第二部分利用Helper-Free系統(tǒng)構(gòu)建cdk5-siRNA腺相關(guān)病毒載體并鑒定 目的 構(gòu)建能表達(dá)cdk5特

3、異性siRNA(cdk5-siRNA)的Ⅱ型重組腺相關(guān)病毒載體，體外觀察其對(duì)cdk5基因的特異性沉默作用。 方法 設(shè)計(jì)一段在體內(nèi)能轉(zhuǎn)錄出特異性cdk5-siRNA的寡核苷酸序列，人工合成該序列后采用基因克隆技術(shù)，將其克隆至通用RNAi表達(dá)質(zhì)粒pSilencer-U6中，構(gòu)建出質(zhì)粒pSilencer-U6-cdk5-siRNA。同時(shí)將EGFP連入表達(dá)質(zhì)粒pAAV-MCS，得到質(zhì)粒pAAV-MCS-EGFP。然后通過PCR從

4、pSilencer-U6-cdk5-siRNA中擴(kuò)增出U6-cdk5-siRNA片段，并將其克隆至pAAV-MCS-EGFP，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒pAAV-MCS-EGFP-cdk5-siRNA-U6。重組質(zhì)粒通過酶切，測(cè)序鑒定后與該系統(tǒng)中的控制質(zhì)粒pAAV-RC、輔助質(zhì)粒pHelper用磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝得到表達(dá)cdk5-siRNA的Ⅱ型重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV2-cdk5-siRNA)。重組病毒純化后通過斑點(diǎn)雜交法測(cè)

5、定滴度，病毒感染體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)其抑制cdk5表達(dá)的特異性和效果。 結(jié)果 各質(zhì)粒構(gòu)建正確，成功包裝出重組腺相關(guān)病毒載體rAAV2-cdk5-siRNA，病毒滴度達(dá)2×1012v.g/ml，重組病毒能感染體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，并能明顯而特異性下調(diào)cdk5的表達(dá)。 結(jié)論 構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV2-cdk5-siRNA能明顯干擾細(xì)胞內(nèi)cdk5的表達(dá)，為進(jìn)一步探索cd