雞IL-5基因的克隆表達(dá)及其重組雞痘病毒的構(gòu)建.pdf

1、白介素-5（interleukin-5，IL-5)是由 Takatsu于1980年發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性介質(zhì)，其能誘導(dǎo) B細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)成熟的 B細(xì)胞分泌 IgM和活化的粘膜 B細(xì)胞分泌合成 IgA，并參與調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的活化、增殖和存活時(shí)間等作用，故 IL-5在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，尤其是粘膜免疫方面起著十分重要的作用。目前人和多種哺乳動(dòng)物的 IL-5已經(jīng)得到了較深入的研究，而對(duì)禽IL-5的研究則相當(dāng)滯后，目前僅Ge

2、nBank收錄一個(gè)由Stuart avery預(yù)測(cè)的雞 IL-5序列，至今尚未見(jiàn)禽 IL-5 cDNA成功克隆及其功能研究方面的相關(guān)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)這條預(yù)測(cè)的雞IL-5核苷酸序列進(jìn)行了以下方面的研究：
　　1.成功克隆了雞 IL-5基因 cDNA根據(jù) Stuart avery所預(yù)測(cè)的雞 IL-5基因序列設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)特異性引物，在國(guó)內(nèi)外首次從 ConA激活的雞體內(nèi)脾臟淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出 IL-5基因 cDNA并對(duì)其各種生物信息

3、進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：所克隆的雞IL-5基因 cDNA全長(zhǎng)381bp，比Stuart avery預(yù)測(cè)的少30 bp，但整體蛋白編碼框架未受影響，共編碼126個(gè)氨基酸，其中N端22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟肽分子量為12.14 Ku，與哺乳動(dòng)物的同源性約為25％，而 Stuart avery預(yù)測(cè)的蛋白與哺乳動(dòng)物的同源性約為23%。雞IL-5蛋白的4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)的大小和位置與人 IL-5相比基本一致，相似的結(jié)構(gòu)預(yù)示雞 IL-5可能執(zhí)行和哺乳動(dòng)物

4、IL-5相似的功能。
　　2.實(shí)現(xiàn)了雞 IL-5基因的原核表達(dá)將所擴(kuò)增的基因克隆至 pET-28a載體構(gòu)建了雞IL-5原核表達(dá)載體并在大腸桿菌Rosetta(DE3)中通過(guò)IPTG的誘導(dǎo)成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。表達(dá)的 IL-5蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化和復(fù)性后，得到了純化和復(fù)性的雞IL-5蛋白，為進(jìn)一步研究禽IL-5的生物學(xué)功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　3.制備了雞IL-5多克隆抗體利用純化和復(fù)性的雞IL-5原核表達(dá)蛋白做為抗原，和弗氏佐

5、劑乳化混合后免疫成年兔，制備了兔抗雞 IL-5多克隆抗體，效價(jià)和特異性、敏感性均已達(dá)到今后實(shí)驗(yàn)的需要,為禽 IL-5的進(jìn)一步研究增加了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　4.構(gòu)建了雞IL-5重組雞痘病毒將雞IL-5全基因連接到雞痘病毒重組質(zhì)粒pEF-gpt12S上構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pEF-gpt-IL-5。然后利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒和雞痘病毒混合感染雞胚成纖維細(xì)胞，利用選擇性培養(yǎng)基篩選重組痘病毒。連續(xù)稀釋純化病毒后，通過(guò)PCR和Wester