CaN Aβ mRNA基因沉默對醛固酮誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抑制作用.pdf

1、背景與目的：心肌肥大是多種心血管疾病的共同病理過程，是導(dǎo)致心原性死亡的最重要的病理基礎(chǔ)之一。近年來，神經(jīng)體液因素尤其是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)失調(diào)所造成的心肌肥大越來越受到重視。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，醛固酮是心肌肥大的重要誘導(dǎo)因素。研究表明，CaN依賴的信號通路可能在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前在心肌肥大的發(fā)生機(jī)制的研究上，有人應(yīng)用RNAi技術(shù)在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上研究有關(guān)肥大的相關(guān)基因，但目前尚無直接針對CaN進(jìn)行RNAi的研

2、究。我們認(rèn)為針對CaN致心肌肥大的瓶頸作用，通過RNAi技術(shù)，進(jìn)行深入研究具有重要意義。本課題在培養(yǎng)的原代大鼠心肌細(xì)胞上，在醛固酮等引起心肌細(xì)胞肥大的刺激因素作用下，同時(shí)應(yīng)用CaN的特異性抑制劑-環(huán)孢霉素A(cyclosporinA,CsA)及醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯，通過測定細(xì)胞大小、肥大相關(guān)基因ANF及β-MHC表達(dá)、CaN基因表達(dá)及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步觀察CaN在醛固酮刺激引起的心肌細(xì)胞肥大中的重要作用。應(yīng)用siRNA特異性引起Ca

3、NAβmRNA的基因表達(dá)沉默，通過測定CaNmRNA及其蛋白表達(dá)水平觀察所選擇的siRNA片段所引起的RNAi的效果，從而更能明確CaNAβmRNA的功能片段所在位置。 方法：取1-3d齡Wistar乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：醛固酮組：每孔加入醛固酮10-9mol/L；空白對照組：不加任何處理因素，與加入處理因素的組別共同進(jìn)行換液處理；靶標(biāo)siRNA組：每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外予以細(xì)胞2μl/孔針對CaN

4、AβmRNA的能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的DNA表達(dá)盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；靶標(biāo)siRNA陰性對照組每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外加入2μl/孔能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA陰性對照的DNA表達(dá)盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；CsA組：每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外加入CsA5×10-3mol/l；螺內(nèi)酯組：每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外加入螺內(nèi)酯3×10-6mol/L。測定各組心肌細(xì)胞表面積，心肌細(xì)胞中肥大相關(guān)基因心房利鈉因子(ANF)及

5、β重鏈肌球蛋白(β-MHC)及CaNAβmRNA的水平，同時(shí)用免疫組化及免疫熒光方法觀察心肌細(xì)胞中CaNAβ及α-actin的表達(dá)。 結(jié)果：醛固酮可使心肌細(xì)胞表面積增加，使心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因ANF、β-MHC的mRNA表達(dá)水平明顯升高，心肌細(xì)胞中CaNAβmRNA表達(dá)明顯升高；心肌胞漿中CaNAβ及α-actin蛋白表達(dá)上調(diào)；CsA及螺內(nèi)酯干預(yù)后，可明顯抑制心肌細(xì)胞表面積的增大，并下調(diào)心肌肥大相關(guān)基因ANF及β-MHCmRNA

6、表達(dá)水平，心肌胞漿中CaNAβ及α-actin表達(dá)亦降低。應(yīng)用siRNA干預(yù)后靶標(biāo)siRNA組大鼠心肌細(xì)胞表面積的增大受到抑制，心肌細(xì)胞中CaNAβmRNA表達(dá)受到明顯抑制，同時(shí)心肌肥大相關(guān)基因ANF及β-MHCmRNA表達(dá)水平未上調(diào)，心肌細(xì)胞胞漿中CaNAβ及α-actin表達(dá)較醛固酮組降低。而靶標(biāo)siRNA陰性對照組大鼠心肌細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)變化均同醛固酮組相似，未受到抑制，心肌細(xì)胞表面積增加，心肌肥大相關(guān)基因ANF、β-MHCmRNA表

7、達(dá)水平明顯升高，心肌細(xì)胞中CaNAβmRNA表達(dá)明顯升高；心肌胞漿中CaNAβ及α-actin蛋白表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：在細(xì)胞分子水平上進(jìn)一步證明醛固酮是大鼠心肌細(xì)胞肥大的重要誘導(dǎo)因素；CaN信號分子參與了醛固酮誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大；應(yīng)用siRNA干擾CaNAβmRNA的表達(dá)，可以抑制醛固酮誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生，首次明確CaNAβmRNA發(fā)揮RNA干擾的siRNA功能片段為1053～1071片段，即CaNAβmRNA在心肌細(xì)胞肥大