慢病毒介導(dǎo)Smad7基因?qū)悄ぴ鲋撑c纖維化的抑制作用.pdf

1、[背景及目的]
　　準(zhǔn)分子激光表層角膜切削術(shù)(surface ablation)包括準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)(photorefractive keratectomy,PRK)、準(zhǔn)分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù)(laser subepithelial keratomileusis,LASEK),微型角膜刀法準(zhǔn)分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù)(epipolis laser in situ keratomileusis,Epi-LASIK),較準(zhǔn)分子

2、激光原位角膜磨鑲術(shù)(laser in situ keratomileusis,LASIK)而言,更為安全,并且減少了術(shù)后像差。所以,表層角膜切削術(shù)受到越來越多的關(guān)注。但是,表層角膜切削術(shù)也有其目前無法避免的不足,即術(shù)后角膜出現(xiàn)上皮下基質(zhì)表層的混濁,排列紊亂的膠原沉積,臨床上稱為角膜上皮下混濁(haze)。Haze是表層角膜切削術(shù)最常見的術(shù)后并發(fā)癥,角膜透明度下降,可引起視力或視覺質(zhì)量下降、屈光回退。既往研究表明haze的產(chǎn)生與角膜創(chuàng)面的

3、愈合過程和角膜細(xì)胞的反應(yīng)直接相關(guān)。角膜創(chuàng)面的愈合過程是由多種細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)。該級聯(lián)反應(yīng)刺激角膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡,繼而誘發(fā)周圍基質(zhì)細(xì)胞移行、活化、增殖,并向肌成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化,同時(shí)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),大量排列紊亂的膠原物質(zhì),以Ⅲ型膠原纖維為主,無規(guī)律沉積于角膜上皮下,即形成haze。所以抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞的移行、活化、增殖和轉(zhuǎn)化,減少膠原物質(zhì)的產(chǎn)生是控制haze的關(guān)鍵。而在haze形成過程中的角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖與

4、纖維化與TGFβ的關(guān)系最為密切,阻斷TGFβ的作用是減少角膜增殖與纖維化,抑制haze的關(guān)鍵。在TGFβ信號傳導(dǎo)過程中,Smad7作為TGFβ受體后下游的抑制型信號傳導(dǎo)因子,起著至關(guān)重要的作用。Smad7可以通過自分泌負(fù)反饋環(huán)來控制TGFβ信號的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。
　　為了探討Smad7基因治療是否能減少角膜愈合過程中基質(zhì)細(xì)胞的增殖與纖維化,本研究選擇Smad7作為外源性目的基因,選用轉(zhuǎn)染效率高、免疫原性低、較為安全的第三代慢病毒作

5、為載體,構(gòu)建Smad7慢病毒載體,將Smad7基因?qū)塍w外培養(yǎng)的大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞和PRK動(dòng)物模型角膜組織內(nèi),通過檢測TGFβ的激動(dòng)型信號傳導(dǎo)因子的活化程度,角膜細(xì)胞的活化增殖和轉(zhuǎn)化指標(biāo),膠原的合成情況,研究Smad7基因?qū)悄ぴ鲋澈屠w維化的作用,為基因治療角膜haze,乃至其它角膜瘢痕,探索新的途徑。
　　[方法]
　　一、大鼠Smad7基因慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　根據(jù)大鼠Smad7基因全序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以大

6、鼠大腦皮層和腎臟總RNA為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得大鼠Smad7cDNA片段,克隆入pcDNA-copGFPLentivector質(zhì)粒進(jìn)行測序。將Smad7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入293細(xì)胞中,觀察GFP的綠色熒光,并用real-timePCR和westernblot方法檢側(cè)Smad7在真核細(xì)胞中的表達(dá)。鑒定后包裝成smad7慢病毒重組載體Lv-Smad7。同法構(gòu)建無Smad7外源基因的空質(zhì)粒慢病毒載體Lv-plasmid作為對照病毒。

7、r>　　二、體外Smad7慢病毒對角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖與纖維化的抑制作用
　　培養(yǎng)大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞,感染Lv-Smad7后檢側(cè)Smad7的表達(dá),建立Smad7陽性細(xì)胞克隆。同樣方法建立空質(zhì)粒陽性細(xì)胞克隆。進(jìn)行分組:①正常細(xì)胞組:正?；|(zhì)細(xì)胞,不加TGFβ2;②TGFβ2對照組:正?；|(zhì)細(xì)胞加TGFβ2共孵育;③空質(zhì)粒組:感染Lv-plasmid的陽性細(xì)胞,加HTGFβ2共孵育;④Smad7組:感染Lv-Smad7的陽性細(xì)胞,加TGFβ

8、2共孵育。TGFβ2的終濃度為10ng/ml。在TGFβ2刺激2h后Westernblot法檢測磷酸化Smad2蛋白(phosphorylated Smad2,p-Smad2)。TGFβ2刺激48h后Westernblot和real-timePCR法檢測α-SMA(α-smooth muscle actin)、Ki67mRNA和蛋白的表達(dá),Ⅲ型膠原蛋白(Type Ⅲ collagen,ColⅢ)mRNA的表達(dá)。MTT法檢測基質(zhì)細(xì)胞生長活

9、性。
　　三、體內(nèi)Smad7慢病毒對角膜增殖與纖維化的抑制作用
　　SD大鼠96眼(右眼)隨機(jī)分為4組:①假手術(shù)組:刮除角膜上皮,不予以激光切削;②手術(shù)組:行PRK手術(shù),即刮除角膜上皮,并予以激光切削:③空質(zhì)粒組:行PRK手術(shù),并予LV-plasmid滴眼;④Smad7組:行PRK手術(shù),并予LV-Smad7滴眼。病毒液滴眼時(shí)間為手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后1w內(nèi)每日1次,以后每周1次。于術(shù)后1d、1w、1m、3m采集角膜標(biāo)本。Real-t

10、imePCR檢測角膜組織中Smad7、TGFβ2、α-SMA、Ki67、colⅢmRNA的表達(dá),Westernblot法檢測角膜組織中Smad7和P-Smad2的表達(dá)。
　　[結(jié)果]
　　一、大鼠Smad7基因慢病毒載體構(gòu)建成功
　　通過PCR擴(kuò)增獲得1.3kbSmad7cDNA片段,與載體連接成Smad7重組質(zhì)粒。測序結(jié)果與GenBank序列一致。Smad7重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別進(jìn)行慢病毒包裝后獲得Lv-Smad7和L

11、v-plasmid,病毒滴度約為1.0×104ifu/μl。
　　二、體外Smad7慢病毒對角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖與纖維化的抑制作用
　　(一)Smad7基因在角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)測定
　　Lv-Smad7體外感染角膜基質(zhì)細(xì)胞后,檢測結(jié)果表明Smad7在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達(dá)均明顯增強(qiáng),證實(shí)Lv-Smad7成功感染基質(zhì)細(xì)胞,并能在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。
　　(二)p-smad2蛋白的Westernblot檢測結(jié)果
　　

12、Smad7組P-Smad2蛋白量較空質(zhì)粒組下降,而TGFβ2對照組較正常細(xì)胞組增加。
　　(三)ColⅢα1鏈mRNA的real-timePCR檢測結(jié)果
　　結(jié)果顯示,TGFβ2可以促使正常角膜基質(zhì)細(xì)胞合成colⅢ增加,TGFβ2對照組與正常細(xì)胞組比較P＜0.05;而導(dǎo)入Smad7后,colⅢα1鏈mRNA的表達(dá)受到抑制,Smad7組為空質(zhì)粒組的38.3％,Smad7組與空質(zhì)粒組比較P＜0.05。
　　(四)α-SMA

13、和Ki67mRNA和蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果
　　TGFβ2可使角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)α-SMA和Ki67的mRNA和蛋白的合成均增多(P均＜0.05),而導(dǎo)入Smad7后,α-SMA和Ki67的合成均受到抑制,Smad7組與空質(zhì)粒組比較,差異有顯著性意義(P均＜0.05)。
　　(五)MTT法檢測細(xì)胞生長活性結(jié)果
　　TGFβ2促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖:而Smad7可阻斷這種作用,使細(xì)胞生長活性減弱,Smad7組與空質(zhì)粒組比較,差異有

14、顯著性意義(P均＜0.05)
　　三、體內(nèi)Smad7慢病毒對角膜增殖與纖維化的抑制作用
　　(一)Smad7mRNA和蛋白在角膜組織中的表達(dá)
　　real-timePCR和WesternBlot結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)Smad7mRNA及蛋白表達(dá)量Smad7組較空質(zhì)粒組增高(P均＜0.05),1m達(dá)高峰,3m時(shí)仍持續(xù)高表達(dá)。
　　(二)角膜組織中p-Smad2蛋白的Westernblot檢測結(jié)果
　　術(shù)后1d起手術(shù)

15、組p-Smad2的表達(dá)即開始增高,并持續(xù)至3m,與假手術(shù)組比較差異有顯著意義(P均＜0.05)。而Smad7組與空質(zhì)粒組比較,在1w、1m、3m時(shí)pSmad2蛋白的表達(dá)量均下降,差異存在顯著性意義(P均＜0.05)。
　　(三)TGFβ2、α-SMA、Ki67、colⅢmRNA的檢測結(jié)果
　?、傩g(shù)后1w、1m、3m時(shí)TGFβ2mRNA的表達(dá)手術(shù)組較假手術(shù)組增高,差異存在顯著性意義(P均＜0.05);而Smad7可減少TGFβ

16、2合成,同時(shí)間點(diǎn)Smad7組較空載質(zhì)粒組TGFβ2明顯減少(P均＜0.05)。
　?、谛g(shù)后1w起α-SMAmRNA的表達(dá)開始增高,1m為高峰,持續(xù)至3m仍有較高表達(dá)(P手術(shù)組vs假手術(shù)組均＜0.05);而Smad7組與空質(zhì)粒組比較,在1w、1m、3m時(shí)α-SMAmRNA的表達(dá)均下降,分別為空質(zhì)粒組的82.7％、67.6％和59.5％(P均＜0.05)。
　?、坌g(shù)后1d起手術(shù)組Ki67mRNA的表達(dá)即增高(P組2vs組1＜0.

17、05),1w及1m為高峰,3m時(shí)Ki67的表達(dá)量較1m時(shí)下降(P3mvs1m＜0.05)。Smad7組1w、1m、3m時(shí)Ki67mRNA的表達(dá)均較空載質(zhì)粒組減少(P均＜0.05)
　?、躢olⅢmRNA的表達(dá)術(shù)后1w起手術(shù)組開始增高,1m為高峰,持續(xù)至3m仍有較高表達(dá),與假手術(shù)組比較差異有顯著意義(P均＜0.05)。而同時(shí)間點(diǎn)Smad7組與空質(zhì)粒組比較,在1w、1m、3m時(shí)colⅢmRNA的表達(dá)量均下降(P均＜0.05)。

18、　　[結(jié)論]
　　一、Smad7慢病毒重組載體構(gòu)建可行,在大鼠角膜體內(nèi)外可高效表達(dá)。
　　二、體外研究表明Smad7基因?qū)氪笫蠼悄せ|(zhì)細(xì)胞可阻斷TGFβ信號傳導(dǎo)通路,減少smad2的磷酸化,阻止基質(zhì)細(xì)胞的活化增殖,阻斷基質(zhì)細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,并且減少膠原蛋白Ⅲ的合成,從而抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和纖維化。
　　三、體內(nèi)研究表明Smad7基因治療可降低大鼠角膜內(nèi)TGFβ2mRNA的表達(dá),減少smad2的磷酸化,阻止角