人源性同種異體去細胞周圍神經(jīng)的制備方法學(xué)與結(jié)構(gòu)組成成分的相關(guān)分析研究.pdf

1、本課題組在組織工程化周圍神經(jīng)方面作了許多研究，在SD大鼠和食蟹猴身上證實了經(jīng)過Triton X-100和Deoxycholate處理的同種異體神經(jīng)修復(fù)2cm以上的神經(jīng)缺損取得較為理想的效果。由于人體神經(jīng)與SD大鼠、猴相比相對粗大，并且神經(jīng)大小差異懸殊；人體神經(jīng)周圍結(jié)締組織更豐富，經(jīng)過化學(xué)處理的時間和程序可能也需要作出相應(yīng)改變。目前文獻與本課題組研究均未涉及到人源性同種異體去細胞神經(jīng)材料的特殊性，故其制備方法的標(biāo)準性必須對制備條件進行重新

2、比較研究來予以確定，標(biāo)準化的制備方法是進行臨床生物安全性檢測與臨床驗證之必不可少的路徑。并且目前所研究的去細胞同種異體去細胞神經(jīng)材料多是基于大鼠或獼猴的動物模型材料，對于人源性材料，究竟其內(nèi)在結(jié)構(gòu)、組織成分、超微結(jié)構(gòu)有什么特點，其相應(yīng)的生物學(xué)行為相關(guān)性有哪些均為研究空白；而這些研究空白的填補，對于人體運用時其生物安全性、有效性的評估，甚至作用機制的闡明均有積極和不可缺少的意義。 因此，本實驗擬在本課題組以往實驗和參考國內(nèi)外相關(guān)文

3、獻的基礎(chǔ)上，通過采用不同流程處理新鮮截肢肢體取得的神經(jīng)，再對處理后神經(jīng)進行大體、HE、Hoechst染色、免疫組化、TEM、電泳和蛋白測定等檢測，確定制備人源性去細胞同種異體神經(jīng)材料的標(biāo)準工藝流程，為臨床神經(jīng)缺損的患者提供可促神經(jīng)再生的理想移植材料；并對按標(biāo)準制備的不同規(guī)格的人源性去細胞神經(jīng)材料結(jié)構(gòu)差異性與殘留物安全性進行比較研究，以利于臨床安全有效的應(yīng)用。 材料和方法： 1.不同化學(xué)萃取流程制備出人源性去細胞同種異體周

4、圍神經(jīng)材料并對其各項觀察指標(biāo)比較分析 1.1以人體神經(jīng)為材料，在本課題組以往實驗和參考國內(nèi)外相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，設(shè)計各種不同流程，制備出人源性去細胞同種異體周圍神經(jīng)材料。 實驗一共分為六組： 第一組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振蕩12h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)1次。 第二組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Tr

5、iton X-100振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)1次。 第三組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩24h→PBS洗3次，每次5min。 第四組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振蕩12h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩12h→PB

6、S洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)1次。 第五組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→125mM SB-10振蕩15h→PBS洗3次，每次5min→0.6 mM SB-16 and0.14％Triton X—200振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)一次。 第六組：未萃取的新鮮神經(jīng)作為對照。 1.2對制備的上述人源性去細胞同種異體周圍神經(jīng)材料進行各種檢測，通過統(tǒng)計學(xué)分析，確定結(jié)構(gòu)保存和細胞成分去除綜合起來

7、最合適的標(biāo)準流程。 觀察指標(biāo)： (1)大體形態(tài)： Fontana橫紋，大小，塌陷程度。 (2)HE染色和細胞核染色(Hoechst染色)：了解雪旺細胞殘留程度及神經(jīng)大體結(jié)構(gòu)的完整性。 (3)免疫組化：anti—laminin反映基底膜；anti—collagenⅠ了解神經(jīng)內(nèi)膜完整性；anti—neurofilament反映軸突；anti—S-100反映雪旺細胞。 (4)髓磷脂堿性蛋白(MBP)測定

8、：Western免疫印跡法。 (5)凱氏定氮法測定制備的人源性去細胞同種異體神經(jīng)材料的蛋白比例。 (6)TEM觀察了解基底膜結(jié)構(gòu)完整及軸突和雪旺細胞、髓鞘殘留程度。 2.標(biāo)準制備的不同規(guī)格的人源性去細胞神經(jīng)材料結(jié)構(gòu)差異性與殘留物安全性進行比較研究。 2.1不同規(guī)格的人源性去細胞同種異體周圍神經(jīng)材料經(jīng)過標(biāo)準的化學(xué)萃取流程制備后的結(jié)果分析。 把人體神經(jīng)依據(jù)粗細分為1.5±0.5cm和5.0±1.0cm

9、兩組，長度均為2cm，均經(jīng)過第一部分中確定的標(biāo)準萃取流程處理，制備成人源性去細胞同種異體神經(jīng)材料。 將制備的材料分別進行HE和Hoechst染色、免疫組化(包括LN、NF、S-100和ColⅠ)以及TEM觀察，比較其基底膜結(jié)構(gòu)的保存完整性和雪旺細胞、軸突去除的程度。 2.2人源性去細胞同種異體周圍神經(jīng)材料制備后清洗液量和次數(shù)對萃取劑殘留濃度的比較。 選取一組制備材料，分別用神經(jīng)與清洗液體積比為1:100和1:30

10、0的PBS液沖洗5遍，每遍留取5ml作MS、LC/MS測定萃取劑(Triton X-100和脫氧膽酸鈉)殘留濃度。 結(jié)果： 1.萃取后的各組神經(jīng)其直徑和長度均稍大于化學(xué)萃取前的新鮮神經(jīng)，顏色呈乳白色半透明狀，神經(jīng)大體輪廓仍完整，質(zhì)地較前疏松，神經(jīng)外膜白色條紋結(jié)構(gòu)消失；在空氣中無塌陷，較易粘著；牽拉各種方法制備去細胞同種異體神經(jīng)，其延展性均較化學(xué)萃取前略增加。其中第二組大體較其它組結(jié)構(gòu)更疏松，韌彈性稍差，可在無張力下行常規(guī)

11、的神經(jīng)吻合。 2.HE和Hoechst染色可見第二組髓鞘和細胞核去除最徹底，其它各組去除均有不同程度的殘留。其中萃取一次組殘留最多，Triton X—200組仍殘留髓鞘和細胞核碎片位于萃取一次組、萃取12h組之間。 3.免疫組化可見經(jīng)過萃取的各組切片均有不同程度的脫片現(xiàn)象，全部六組中LN和ColⅠ染色都呈陽性，第二組可見基底膜結(jié)構(gòu)稍欠完整；第一、二組NF和S-100染色均陰性，萃取一次組、萃取12h組、Triton X—

12、200組有陽性表現(xiàn)，萃取一次組陽性尤其明顯。 4.MBP電泳見萃取一次組、萃取12h組仍有髓磷脂堿性蛋白殘留，其余各萃取組未見明顯MBP條帶。 5.TEM可見第二組萃取最干凈且基底膜保持完整，與其它萃取組有統(tǒng)計學(xué)差異；萃取一次組、萃取12h組、Triton X—200組基底膜完整，有髓鞘和細胞碎片存留，尤以萃取一次組存留最多；對照組神經(jīng)結(jié)構(gòu)正常。 6.凱氏定氮法顯示萃取制備的各組人源性去細胞同種異體神經(jīng)中，第一組

13、為7.1％，第二組為6.5％，萃取一次組為10.9％，萃取12h組為8.4％，Triton X—200組為9.1％，對照組為13.1％。其中第二組中蛋白比例最低，表示其雪旺細胞和軸突成分去除最徹底。 7.不同規(guī)格的人源性去細胞周圍神經(jīng)材料經(jīng)過標(biāo)準萃取流程處理后，其HE、Hoechst染色、免疫組化包括LN、NF、S-100、ColⅠ染色以及透射電鏡觀察，其神經(jīng)形態(tài)的完整性和雪旺細胞、軸突去除干凈程度未見有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

14、 8.PBS清洗液與制備萃取好的神經(jīng)體積比1:300比其比值為1:100更能降低Triton X-100和Deoxycholate的殘留濃度，兩種體積比之間可見有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論： 1.經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)萃取處理程序，人源性同種異體周圍神經(jīng)可獲得生物物理性狀與外科縫合條件下大致可滿足臨床修復(fù)的脫細胞支架材料。 2.此種脫細胞材料在經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚碇螅杀３只啄そY(jié)構(gòu)的完整，已幾乎不殘留細胞與髓鞘成分。組織內(nèi)示意

15、蛋白含量的氮含量最大降低量超過50％(13.1-6.5)。本實驗對比研究提供了完整的組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、透射電鏡和蛋白電泳及氮含量測定的依據(jù)。 3.據(jù)現(xiàn)有研究資料可以認為上述檢測指標(biāo)可作為確定適當(dāng)或理想的化學(xué)萃取制備工藝流程的質(zhì)量控制指標(biāo)，而能達到此質(zhì)量控制指標(biāo)的流程可設(shè)計為生產(chǎn)可供臨床試用產(chǎn)品的企業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準，(事實上我們此標(biāo)準流程已獲中國藥品生物制品檢定所批準為企業(yè)送檢合格產(chǎn)品之生產(chǎn)標(biāo)準)。 4.本研究確認的制備人源

16、性同種異體神經(jīng)去細胞支架材料的標(biāo)準方法流程為：神經(jīng)無菌PBS液泡洗2h→3％ Triton X-100振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→4％脫氧膽酸鈉液振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→3％ Triton X-100振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→4％脫氧膽酸鈉液振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→PBS液(含100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)中0-4℃保存?zhèn)溆? 5.經(jīng)過標(biāo)準流程制備