PI3K信號(hào)介導(dǎo)小鼠外周ephrinBs-EphBs信號(hào)激活引起的痛行為.pdf

1、目的:
　　 EphBs 受體及ephrinBs 配體存在于成年的大腦及外周組織中，在各種病理過(guò)程、生理功能中具有重要作用。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，ephrinBs 作為致敏物質(zhì)，通過(guò)激活外周ephrinBs / EphBs 信號(hào)系統(tǒng)引起外周敏感化和痛覺(jué)過(guò)敏，但是機(jī)制尚未明了。PI3K 涉及眾多生理功能和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。研究證明PI3K 信號(hào)通路參與傷害性信息調(diào)制，介導(dǎo)傷害刺激引起的外周、中樞敏感化，如介導(dǎo)NGF/TrkA 和GDN

2、F/Ret 信號(hào)激活引起的外周敏感化和痛覺(jué)過(guò)敏等。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)PI3K 參與調(diào)節(jié)EphBs 受體的激活。本研究目的是證明PI3K 是否參與介導(dǎo)外周ephrinBs / EphBs信號(hào)激活引起的痛行為。
　　 方法:
　　 1、足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl 后分別于10min、30min、1h、4h 及8h 時(shí)間點(diǎn)取足底注射部位皮膚, 用蛋白電泳檢測(cè)外周注射ephrinB1-Fc 引起相應(yīng)注射部位皮

3、膚PI3K-p110γ及pAkt 表達(dá)變化的時(shí)間相。
　　 2、足底注射ephrinB1-Fc 0.02μg、0.1μg、0.5μg/10μl，30min 后，用蛋白電泳檢測(cè)外周注射ephrinB1-Fc 引起相應(yīng)注射部位皮膚PI3K-p110γ及pAkt 表達(dá)變化的劑量依賴性。
　　 3、足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，15min 后，使用免疫熒光方法檢測(cè)ephrinB1-Fc相應(yīng)注射部位皮膚pA

4、kt 表達(dá)的增加是否存在于外周傷害性感受器中；檢測(cè)注射側(cè)腰5 DRG pAkt 表達(dá)變化及pAkt 與NK1 受體共表達(dá)情況。
　　 4、PI3K 抑制劑wortmannin 0.4μg/10μl 或LY294002 5μg/10μl 預(yù)處理，30min 后足底同一部位注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，ephrinB1-Fc 注射30min 后用蛋白電泳檢測(cè)相應(yīng)注射部位皮膚pAkt 表達(dá)變化，研究Akt 的激活是

5、否通過(guò)PI3K 介導(dǎo)。
　　 5、PI3K 抑制劑wortmannin 0.016、0.08、0.4μg/10μl 和LY294002 0.2、1、5μg/10μl預(yù)處理30min 或后處理1h，足底同一部位注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，檢測(cè)預(yù)處理組ephrinB1-Fc 注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h 及48h 和后處理組ephrinB1-Fc注射后2h 的熱縮足反射潛伏期、機(jī)械縮足反射閾值

6、，觀察注射PI3K 抑制劑對(duì)ephrinB1-Fc 引起的痛行為的影響。
　　 6、PI3K 抑制劑wortmannin 0.4μg/10μl 和LY294002 5μg/10μl 預(yù)處理30min 或后處理1h，檢測(cè)ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl 足底注射后1h(預(yù)處理組)或2h（后處理組）腰4、5 脊髓背角Fos 蛋白的表達(dá)。
　　 7、PI3K 抑制劑wortmannin 0.016、0.08、0.4

7、μg/10μl 或LY294002 0.2、1、5μg/10μl預(yù)處理30min，足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl，30min 后使用蛋白電泳法檢測(cè)相應(yīng)注射部位皮膚pERK的表達(dá)，研究PI3K在ephrinB1-Fc 引起的注射部位皮膚ERK激活中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、足底注射ephrinB1-Fc 后相應(yīng)注射部位皮膚PI3K-p110γ表達(dá)呈時(shí)間依賴性、劑量依賴性增加，30min 達(dá)到最

8、高峰，8h 恢復(fù)基礎(chǔ)水平；pAkt 表達(dá)呈時(shí)間依賴性、劑量依賴性增加，10min 即可檢測(cè)到明顯增加，30min 到1h 間達(dá)到最高峰，持續(xù)至少8h。足底注射ephrinB1-Fc 15 min 后注射部位皮膚pAkt 的表達(dá)增加主要集中在傷害性感受器密集的表皮；注射側(cè)腰5 DRG pAkt 表達(dá)增加，并且部分與NK1受體共表達(dá)。PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預(yù)處理能阻斷ephrinB1-Fc 引起的足底皮膚

9、pAkt 表達(dá)的增加。
　　 2、PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預(yù)處理或后處理能防止或逆轉(zhuǎn)ephrinB1-Fc足底注射引起的熱、機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏，并且隨劑量的增加抑制程度增加。3、PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預(yù)處理或后處理能防止或逆轉(zhuǎn)ephrinB1-Fc足底注射引起的脊髓背角Fos 蛋白表達(dá)的增加。
　　 4、PI3K 抑制劑wortmannin 或LY29400