shRNA阻斷Ⅲ型PI3K信號傳導(dǎo)通路對人胃癌SGC7901細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：①構(gòu)建靶向阻斷人胃癌SGC7901細(xì)胞III型PI3K信號傳導(dǎo)通路的小發(fā)夾RNA(Short Hairpin RNA，shRNA)重組質(zhì)粒，觀察其對靶基因PI3KC3 mRNA表達(dá)的抑制效果，并篩選出一條具有高效抑制作用的shRNA序列；②利用RNA干擾技術(shù)特異性阻斷III型PI3K信號傳導(dǎo)通路后，觀察shRNA對人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬的影響。 方法：①選擇針對人III型PI3K信號傳導(dǎo)通路mRNA的特

2、異性shRNA靶序列，分別構(gòu)建4個不同位點(diǎn)的靶向PI3KC3基因shRNA干擾的重組質(zhì)粒，并采用基因測序法以確保shRNA干擾序列已正確插入載體中；②將表達(dá)shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于胃癌SGC7901細(xì)胞，利用shRNA干擾技術(shù)阻斷III型PI3K信號傳導(dǎo)通路，分別在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第24 h、48 h、72 h后鏡下觀察胃癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；③在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測目的基因PI3KC3 mRNA表達(dá)值的

3、變化，并篩選出一條具有高效抑制III型PI3K信號傳導(dǎo)通路的shRNA干擾序列；④采用表達(dá)shRNA的質(zhì)粒通過RNA干擾技術(shù)特異性阻斷III型PI3K信號傳導(dǎo)通路后，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測胃癌SGC7901細(xì)胞自噬相關(guān)基因MAP-LC3 mRNA和凋亡相關(guān)基因p53、PUMA mRNA表達(dá)值的變化。 結(jié)果：①成功構(gòu)建的4條靶向干擾III型PI3K信號傳導(dǎo)通路的shRNA靶序列，經(jīng)基因測序證明shRNA已正確插入質(zhì)粒載體中

4、；②表達(dá)shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于胃癌SGC7901細(xì)胞24 h后鏡下觀察見細(xì)胞出現(xiàn)胞體皺縮、細(xì)胞間隙增寬，48 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯皺縮，部分細(xì)胞脫落，72 h后見較多細(xì)胞脫落；③質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞48 h后行實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組PI3KC3 mRNA表達(dá)值的變化，各shRNA干擾組的胃癌細(xì)胞PI3KC3 mRNA表達(dá)均下調(diào)，其中shRNA靶序列(No.712)組PI3KC3 mRNA表達(dá)值下調(diào)至對照組的15.17％±2

5、.21％(p<0.05)；④表達(dá)shRNA(No.712)的質(zhì)粒特異性阻斷Ⅲ型PI3K信號通路后，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測顯示：shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌SGC7901細(xì)胞內(nèi)自噬特異性蛋白基因MAP- LC3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)至對照組的28.02％±2.65％；凋亡相關(guān)基因p53和PUMA mRNA的表達(dá)水平分別上調(diào)至對照組的475.62％±8.36％和180.24％±4.17％(P＜0.05)。 結(jié)論：①構(gòu)建的shRN

6、A重組質(zhì)粒能有效抑制胃癌SGC7901細(xì)胞PI3KC3基因的表達(dá)；篩選的shRNA靶序列(5’-TCCGCTTAGACCTGTCGGATGAAGAGGCT-3’)為阻斷Ⅲ型PI3K信號傳導(dǎo)通路的最佳序列；②應(yīng)用shRNA特異性阻斷Ⅲ型PI3K信號傳導(dǎo)通路后，明顯下調(diào)了胃癌SGC7901細(xì)胞自噬基因LC3 mRNA的表達(dá)；③shRNA特異性阻斷Ⅲ型PI3K信號傳導(dǎo)通路后，使凋亡相關(guān)基因p53、PUMA mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)；④shRNA