PI3K介導(dǎo)ephrinBs-EphBs信號相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制.pdf

1、目的：
　　 EphBs受體及ephrinBs配體存在于成年的大腦及組織中，在各種病理過程、生理功能中具有重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ephrinBs作為致敏物質(zhì)，通過激活中樞ephrinBs/EphBs信號系統(tǒng)引起中樞敏感化和痛覺過敏，但是機制尚未明了。PI3K涉及眾多生理功能和病理過程的調(diào)節(jié)。研究證明PI3K信號通路參與傷害性信息調(diào)制，介導(dǎo)傷害刺激引起的中樞敏感化，如介導(dǎo)NGF/TrkA和GDNF/Ret信號激活引起的中樞敏感

2、化和痛覺過敏等。其他研究領(lǐng)域已有實驗證實EphBs受體參與調(diào)節(jié)PI3K的激活。本研究目的是證明PI3K是否參與介導(dǎo)中樞脊髓ephrinBs/EphBs信號激活引起的痛行為。
　　 方法：
　　 ①為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否引起時間和劑量依賴性的痛覺過敏，鞘內(nèi)注射不同劑量ephrinBl-Fc(0.02，0.1，0.5μg，溶于10μl生理鹽水中)，注射后30min，1，2，4，8，24，48h檢測熱縮足反射

3、潛伏期及機械縮足反射閾值；為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否引起劑量依賴性的脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達，鞘內(nèi)注射不同劑量的ephrinBl-Fc(0.02，0.1，0.5μg)，注射后2h，采用免疫組織化學方法檢測脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達。
　　 ②為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否時間依賴性激活脊髓PI3K及其下游信號蛋白磷酸化AKT，鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.5μg/10μl后分別于10min、30

4、min、1h、4h及8hN間點取注射部位脊髓，用蛋白電泳檢測鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc引起相應(yīng)注射部位脊髓PI3K-p110γ及P-AKT表達變化的時間相；為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否劑量依賴性激活脊髓PI3K及其下游信號蛋白磷酸化AKT，鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.02μg、0.1μg、0.5μg/10μl，30min后，用蛋白電泳檢測鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc引起相應(yīng)注射部位脊髓PI3K-p110γ及p-A

5、KT表達變化；為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc引起AKT的激活是否通過PI3K介導(dǎo)，鞘內(nèi)注射PI3K抑制劑wortmannin0.4μg/10μl或LY2940025μg/10μl預(yù)處理，30min后同一部位鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.5μg/10μl，再30min后用蛋白電泳檢測相應(yīng)注射部位脊髓p-AKT表達變化。
　　 ③為觀察PI3K抑制劑對ephrinBl-Fc引起的痛行為的影響。鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc

6、0.5μg/10μl，前30min(預(yù)處理)或后30min(后處理)鞘內(nèi)注射PI3K抑制劑wortmannin0.016、0.08、0.4μg/10μl和LY2940020.2、1、5μg/10μl，檢測預(yù)處理組最后一次注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h及48h和后處理組最后一次注射后0.5h、1h、2h、4h、8h的熱縮足反射潛伏期、機械縮足反射閾值；為觀察PI3K抑制劑對ephdrdBl-Fc引起的脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋

7、白表達的影響，PI3K抑制劑wortmannin0.4μg/10μl和LY2940025μg/10μl預(yù)處理30min或后處理30min，檢測最后一次注射后2h腰4、5脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白的表達。
　　 ④為觀察EphB受體是否參與福爾馬林引起的中樞PI3K的激活。在注射福爾馬林(1％，10μl)前30分鐘，鞘內(nèi)注射EphB受體阻斷劑EphBl-Fc(0.5μg)，記錄注射福爾馬林后0～5min和15～30min的累積舔足時

8、間和縮足反應(yīng)次數(shù)，蛋白電泳檢測福爾馬林注射后30min脊髓PI3K和p-AKT表達，免疫組織化學方法檢測2h后脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達。
　　 ⑤為觀察EphB受體是否參與神經(jīng)病理性疼痛引起的中樞PI3K的激活。EphB受體阻斷劑EphBl-Fc(0.5μg)在CCI模型建立前后鞘內(nèi)給藥3次(CCI前1h，后1d，3d)(預(yù)處理)或單次鞘內(nèi)給藥(CCI后5d)(后處理)，檢測多次給藥組CCI模型建立后1d、3d、5d、7d和

9、單次給藥組CCI模型建立后1d、3d、5d(給藥后0.5h、1h、2h、4h、8h)、6d、7d的熱縮足反射潛伏期、機械縮足反射閾值，蛋白電泳檢測多次給藥組CCI模型建立后5d和單次給藥組給藥后2h脊髓PI3K和p-AKT表達，免疫組織化學方法檢測多次給藥組CCI模型建立后5d和單次給藥組給藥后2h脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達。
　　 ⑥為觀察PI3K在ephrinBl-Fc引起的注射部位脊髓ERK激活中的作用。PI3K抑制劑w

10、ortmannin0.4μg/10μl或LY2940025μg/10μl鞘內(nèi)注射30min后(預(yù)處理)，鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.5μg/10μl，30min后使用蛋白電泳法檢測相應(yīng)注射部位脊髓P-ERK的表達。
　　 結(jié)果：
　　 ①鞘內(nèi)注射EphBs受體激動劑ephrinBl-Fc，小鼠的熱縮足反射潛伏期及機械縮足反射閾值呈時間依賴性和劑量依賴性降低，30min即可檢測到明顯降低，2h達到最低值，降低過程至少

11、持續(xù)到24h，48h后趨于正常；鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc后相應(yīng)注射部位脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達呈劑量依賴性增加。
　　 ②鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc后相應(yīng)注射部位脊髓PI3K-p110γ表達呈時間依賴性和劑量依賴性增加，10min即可檢測到明顯增加，30min達到最高峰，8h恢復(fù)基礎(chǔ)水平；p-AKT表達呈時間依賴性和劑量依賴性增加，1h達到最高峰，持續(xù)至少8h；PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)

12、處理能阻斷ephrinBl-Fc引起的注射部位脊髓p-AKT表達的增加。
　　 ③PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)處理或后處理能部分防止或逆轉(zhuǎn)ephrinBl-Fc鞘內(nèi)注射引起的熱、機械痛覺過敏，并且隨劑量的增加抑制程度增加；PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)處理或后處理能防止或逆轉(zhuǎn)ephrinBl-Fc鞘內(nèi)注射引起的脊髓背Fos蛋白表達的增加。
　　 ④Eph受體阻斷劑EphB

13、l-Fc預(yù)處理能夠減少福爾馬林引起的舔足時間，縮足反應(yīng)次數(shù)及脊髓Fos蛋白、PI3K和p-AKT表達。
　　 ⑤Eph受體阻斷劑EphBl-Fc預(yù)處理或后處理能夠部分逆轉(zhuǎn)神經(jīng)病理性疼痛引起的熱、機械痛覺過敏及脊髓Fos蛋白、PI3K和p-AKT表達。
　　 ⑥PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)處理防止ephrinBl-Fc鞘內(nèi)注射引起的相應(yīng)注射部位脊髓p-ERK表達增加，并且呈劑量依賴性抑制。