PI3K與ERK信號(hào)通路通過(guò)FOXO1調(diào)控A549細(xì)胞周期和凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　 肺癌是全球范圍內(nèi)因癌癥死亡的首要原因,我國(guó)每年大約有60萬(wàn)人死于肺癌,其中非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma,NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%～85%。腫瘤發(fā)生是涉及原癌基因和抑癌基因參與的多基因、多步驟過(guò)程,是細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失衡的結(jié)果。肺癌的發(fā)生、發(fā)展受到細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),在肺腫瘤中磷脂酰肌醇-3一激酶(Phosphotylinosital3kin

2、aSe,PI3K)/Akt和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性異常增高,一旦阻斷這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,則可以引起細(xì)胞周期阻滯,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 FOXO1轉(zhuǎn)錄因子屬于Fox(Forkheadbox)家族成員,近年來(lái)被認(rèn)為是一類極其重要的蛋白家族,可以調(diào)控許多基因的表達(dá),參與細(xì)胞的分化、氧化應(yīng)激的抵抗、DNA的損傷修復(fù)、

3、細(xì)胞周期停滯以及細(xì)胞凋亡。FOXO1轉(zhuǎn)錄因子作為一個(gè)抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物,其活性受到多層次的調(diào)節(jié),其中磷酸化修飾可減弱其DNA結(jié)合能力,抑制其轉(zhuǎn)錄活性。在許多癌癥中PI3K/Akt和MAPK/ERK通路異常激活,通過(guò)磷酸化修飾導(dǎo)致FOXO1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。MAPK通路和PI3K通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的兩條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,由于這兩條信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖都具有正性的調(diào)節(jié)作用,因而人們認(rèn)為它們之間存在著一定程度的交互作用,值得強(qiáng)調(diào)的是,F

4、OXO1蛋白恰巧處于兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的匯聚點(diǎn)。研究表明,在胰島β細(xì)胞中,低血清的環(huán)境下PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路能夠共同抑制FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖。但在非小細(xì)胞肺癌中,PI3K/Akt和MAPK/ERK兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)FOXO1因子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)及其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選取肺正常細(xì)胞HBE及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為研究對(duì)象,選用PI3K特異性抑制劑LY294002和ERK通路特異性抑制劑UO126

5、處理細(xì)胞,觀察A549細(xì)胞中PI3K/AktMAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)FOXO1蛋白以及對(duì)FOXO1下游靶基因Bim、p27Kipl表達(dá)的影響,進(jìn)而加深PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡中分子調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng),LK2、A549細(xì)胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液、HBE和H460細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、飽和濕度、37

6、℃、5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。
　　 2、細(xì)胞分組,將生長(zhǎng)至70%匯合度的A549細(xì)胞分組,處理組1加入LY294002(濃度25μmol/L),處理組2加入U(xiǎn)O126(深度10μmol/L),處理組3同時(shí)加入LY294002(濃度25μmol/L)和UO126(濃度10μmol/L),對(duì)照組加入等體積的DMSO,作用24小時(shí)候收集細(xì)胞。
　　 3、MTT比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LY294002(濃度25μmol/L)、UO126(

7、濃度10μmol/L)、LY294002(濃度25μmol/L)和UO126(濃度10μmol/L),對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況的影響,并繪制生長(zhǎng)曲線,篩選藥物的最佳作用時(shí)間。
　　 4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytoMetry,FCM)檢測(cè)A549細(xì)胞中對(duì)照組及各加藥處理組細(xì)胞周期變化。
　　 5、應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞中對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組FOXO1、Bim、p27Kipl基因的表達(dá)差異。
　　 6、應(yīng)

8、用Western-blot法檢測(cè)肺正常細(xì)胞與肺癌細(xì)胞系中FOXO1、p-FOXO1的蛋白表達(dá),及A549細(xì)胞中對(duì)照組及各加藥處理組FOXO1、p-FOXO1、Bim、p27Kipl蛋白的表達(dá)變化。
　　 7、應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)FOXO1在非小細(xì)胞肺癌A549中的細(xì)胞定位情況及不同加藥組處理后FOXO1亞細(xì)胞定位變化。
　　 8、Annexin-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)A549細(xì)胞中對(duì)照組及各加藥處理組細(xì)胞凋亡情況。
　

9、　 結(jié)果：
　　 1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化
　　 與對(duì)照組相比LY294002和UO126都能明顯的抑制A549細(xì)胞的增殖,且具有時(shí)間依賴性,兩種藥物聯(lián)合處理后對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用更加明顯,藥物作用24小時(shí)時(shí),細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到最大抑制率。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程
　　 FCM結(jié)果顯示,用LY294002和UO126作用A549細(xì)胞24小時(shí)后,細(xì)胞周期進(jìn)程大部分被阻滯在G1期,并且兩種藥物

10、聯(lián)合時(shí),細(xì)胞周期被阻滯在Gl期的數(shù)量較單藥組增多,而S期明顯減少。
　　 3、RT-PCR法檢測(cè)FOXO1、Bim、p27Kipl基因的表達(dá)
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,在A549細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,各加藥處理組FOXO1基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異,而B(niǎo)im、p27Kipl基因表達(dá)水平均升高a且聯(lián)合藥物組Bim和p27Kipl基因表達(dá)相應(yīng)增加。
　　 4、Westem-blot法檢測(cè)FOXO1、p-FOXO1、Bi

11、m、p27Kopl蛋白的表達(dá)
　　 Westenlblot結(jié)果顯示,肺正常細(xì)胞與肺癌細(xì)胞系中FOXO1的蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異,但磷酸化水平與其他幾種肺癌細(xì)胞系相比較低。A549細(xì)胞經(jīng)抑制劑作用24小時(shí)后,與對(duì)照組相比FOXO1的蛋白水平未見(jiàn)顯著性變化,而FOXO1的磷酸化水平明顯下降,Bim、p27Kipl的表達(dá)相應(yīng)增加。且聯(lián)合用藥組p-FOXO1進(jìn)一步下降,Bim和p27Kipl表達(dá)相應(yīng)增加。兩種藥物單獨(dú)及聯(lián)合作用前后總的FOX

12、O1的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。
　　 5、免疫熒光法檢測(cè)FOXO1亞細(xì)胞定位
　　 免疫熒光結(jié)果顯示,對(duì)照組FOXO1蛋白主要定位于細(xì)胞漿,抑制劑LY294002及UO126單獨(dú)用藥組FOXO1部分向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,LY294002和UO126聯(lián)合處理A549細(xì)胞時(shí),FOXO1蛋白大部分積聚于胞核。
　　 6、Annexin-FITC雙染方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 LY294002和UO126作用A549細(xì)胞24小時(shí)

13、后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞凋亡率增加,藥物聯(lián)合作用后,與單獨(dú)用藥組相比,細(xì)胞的凋亡率明顯高于單獨(dú)用藥組。
　　 結(jié)論：
　　 1、PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的細(xì)胞增殖中發(fā)揮相當(dāng)關(guān)鍵的調(diào)控作用。
　　 2、PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的FOXO1磷酸化,促進(jìn)A549細(xì)胞中FOXO1因子核漿穿梭。
　　 3、抑制PI3K/Akt和MAPK/ER