SiRNA阻斷Ⅲ型PI3K信號轉導通路對人胃癌SGC7901細胞的影響.pdf

1、目的:①構建靶向阻斷Ⅲμ±型PI3K信號轉導通路的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)重組質粒,包裝重組腺病毒PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD；②研究siRNA阻斷Ⅲ型PI3K信號轉導通路后對人胃癌SGC7901細胞增殖、凋亡和自噬的影響。
　　 方法:①選擇針對人Ⅲ型PI3K信號轉導通路mRNA的特異性siRNA靶序列,構建靶向PI3KC3基因siRNA干擾的重組質粒,并采用基因測序法以確保siR

2、NA干擾序列已正確插入載體中；將表達siRNA的穿梭質粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的輔助包裝質粒共轉染HEK293細胞,利用AdMaxTM腺病毒包裝系統(tǒng)制備重組腺病毒包裝PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD；②PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD轉染胃癌SGC7901細胞,siRNA阻斷Ⅲ型PI3K信號轉導通路后,采用MTT法測定對SGC7901細胞生長的抑制作用,應用流式細胞技術JC-1法檢測對SGC7901細胞線粒體膜電位的影響,應用MDC熒光

3、染色法觀察自噬的發(fā)生,Western blot測定自噬特異性蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3,LC3)表達,計算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值反映自噬水平。
　　 結果:①成功構建的特異性阻斷Ⅲ型PI3K信號轉導通路的PI3KC3-siRNA質粒,經(jīng)基因測序證實siRNA靶序列已正確插入質粒載體；包裝的重組腺病毒PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD及對照腺病毒N

4、C-RNAi-GFP-AD滴度分別為2.0×1011 pfu/L,和1.8×1011 pfu/L；腺病毒對胃癌SGC7901細胞感染復數(shù)(multiple of infection,MOI)為30時轉染效果最好。②PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD轉染胃癌SGC7901細胞后胃癌SGC7901細胞的增殖明顯受到抑制,實驗組24h、48h、72h的吸光度分別為0.30±2.00％、0.33±1.77％、0.42±2.36％,對照組24h、48

5、h、72h的吸光度分別為0.40±4.25％、0.58±3.29％、0.85±3.25％(p<0.05),計算24h、48h、72h抑制率為25.31％±7.30％、43.71％±4.35％、50.89％±2.84％；流式細胞術檢測結果顯示實驗組綠色熒光的細胞占總細胞的比值24h、48h、72h分別為19.6％±2.65％、35.7％±6.62％、50.4％±7.39％,對照組72h為12.3％±2.17％(p<0.05),綠色熒光的細

6、胞數(shù)量占總細胞數(shù)的比值越大,線粒體膜電位就越低；MDC熒光染色觀察結果顯示:實驗組隨著時間延長(6h、12h、24h)自噬囊泡逐漸減少,對照組24h自噬囊泡比實驗組各組都多；LC3的表達實驗組6h、12h、24hLC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值分別為0.876±7.51％、0.356±2.99％、0.145±1.98％,而對照組的24hLC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值為1.267±4.93％(p<0.05)。
　　 結論:①成功構建了特異性阻斷Ⅲ型