紫杉醇突變株的篩選和基因克隆.pdf

1、紫杉醇是一種高效、低毒、廣譜、作用機(jī)制獨(dú)特的天然抗腫瘤藥物。紫杉醇的市場(chǎng)供應(yīng)受制于原料來(lái)源和制備技術(shù)兩方面的制約，使得藥價(jià)昂貴。而真菌大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇具有誘人的發(fā)展前景，將產(chǎn)生巨大的市場(chǎng)效益和社會(huì)效益。
　　 本實(shí)驗(yàn)室從廢紙中分離篩選到一株腐生真菌擬盤多毛孢(Pestalotiopsis sp.)NK-17，經(jīng)過(guò)TLC、HPLC、MS、NMR分析證實(shí)此菌的發(fā)酵產(chǎn)物中確實(shí)含有紫杉醇，產(chǎn)量為400μg/L，但仍不能滿足工業(yè)化

2、生產(chǎn)所需，所以需要對(duì)菌株進(jìn)行改造以構(gòu)建高產(chǎn)菌株。
　　 為了探究NK-17中紫杉醇的代謝途徑，本文利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法建立了NK-17的基因組隨機(jī)突變庫(kù)。首先將攜帶構(gòu)巢曲霉色氨酸合成基因(TRPC)的啟動(dòng)子的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPH)的二元載體，用CaCl2法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，然后將此重組根癌農(nóng)桿菌與NK17的孢子在24℃下共培養(yǎng)48 h，以潮霉素抗性

3、基因作為篩選標(biāo)記而獲得大量轉(zhuǎn)化子。
　　 本文將單孢分離純化后的NK-17轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)TLC法初步鑒定、HPLC定性定量檢測(cè)及MS分析，篩選得到4株發(fā)酵產(chǎn)物不含紫杉醇的轉(zhuǎn)化子，分別命名為TX-27、TX-79、TX-95、TX-158。Southern blot結(jié)果顯示TX-79、TX-95均為T-DNA單拷貝隨機(jī)插入，TX-27為雙拷貝隨機(jī)插入，TX-158為三拷貝隨機(jī)插入。以TX-79為研究對(duì)象，利用反向PCR技術(shù)獲