靶向stathmin和mdrl基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥的研究.pdf

1、目的:探討以RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)靶向stathmin(STMN1)和mdr1基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥的可行性。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建分別靶向stathmin和mdr1基因的小發(fā)卡(small hairpin RNA,shRNA)結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒:pGU6-GFP-neo-STMN1和pGU6-GFP-neo-MDR1,并進(jìn)行酶切和測序鑒定。
　　 2.用脂質(zhì)體Lip

2、ofectamine2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人卵巢上皮癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV3/TAX,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測stathminm和mdr1基因的mRNA變化,Western-blot檢測其蛋白表達(dá)變化。
　　 3.將質(zhì)粒單轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染到SKOV3/TAX,Hoechst33342與PI雙染后熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡情況,CCK-8法分析細(xì)胞增殖情況和對(duì)紫杉醇的敏感性。
　　 結(jié)果:
　　

3、 1.成功構(gòu)建pGU6-GFP-neo-STMN1和pGU6-GFP-neo-MDR1質(zhì)粒,酶切鑒定和測序提示質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　 2.Real-time PCR及Western-blot顯示紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV3/TAX的stathmin和mdr1基因的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于人卵巢上皮癌細(xì)胞SKOV3(P＜0.05)。SKOV3/TAX細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,pGU6-GFP-neo-MDR1質(zhì)粒對(duì)mdr1基因,pGU6-GFP

4、-STMN1質(zhì)粒對(duì)stathmin基因在mRNA和蛋白水平均有明顯抑制(P＜0.05),陰性對(duì)照組與SKOV3/TAX細(xì)胞組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.各組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342與PI雙染后,熒光顯微鏡下可見對(duì)照組SKOV3/TAX細(xì)胞著色很淺;轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組變化不明顯;轉(zhuǎn)染pGU6-GFP-neo-MDR1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pGU6-GFP-neo-STMN1質(zhì)粒組凋亡細(xì)胞增多;SKOV3/TAX細(xì)胞共轉(zhuǎn)染組有較多明亮的

5、藍(lán)色熒光著色細(xì)胞核,染色質(zhì)濃縮,還有凋亡小體,凋亡最明顯。
　　 4.CCK-8示單獨(dú)轉(zhuǎn)染pGU6-GFP-neo-MDR1質(zhì)?；騪GU6-GFP-neo-STMN1質(zhì)粒均能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,逆轉(zhuǎn)耐藥,共轉(zhuǎn)染組效果更好。
　　 結(jié)論:
　　 體外RNAi可有效沉默卵巢癌紫杉醇耐藥株SKOV3/TAX細(xì)胞內(nèi)stathmin和mdr1基因的表達(dá),兩個(gè)單靶點(diǎn)干擾均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制增殖,逆轉(zhuǎn)其紫杉醇耐藥,雙靶點(diǎn)聯(lián)