結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞cDNA文庫和pGBKT7-SAKS1重組質(zhì)粒構(gòu)建.pdf

1、一、結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞株SW1116/HCPT酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建 目的：構(gòu)建羥基喜樹堿耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116/HCPT的酵母雙雜交cDNA文庫。 方法：采用CLONTECH SMART（switching mechanism at 5'end of RNA transcript）技術(shù)和同源重組（homologous recombination）的方法構(gòu)建SW1116/HCPT細(xì)胞株的cDNA文庫。即

2、用Trizol提取細(xì)胞總RNA，以此為模板，CDSⅢ Oligo dT為引物，并加入轉(zhuǎn)換模板（switching template），逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈。加入SMART ⅢTM Oligo dT作為第二鏈合成的引物，進(jìn)行長距離(LD)-PCR合成雙鏈cDNA，后者經(jīng)CLONTECH CHROMA SPIN+TE-400柱純化后與線性質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母菌AH109，兩者利用酵母細(xì)胞內(nèi)較高活性的同源重組酶，進(jìn)行同源重組成

3、環(huán)形的有復(fù)制活性的文庫質(zhì)粒，在缺亮氨酸培養(yǎng)板上篩選出所有克隆，即為SW1116/HCPT細(xì)胞株的酵母雙雜交cDNA文庫。 結(jié)果：共獲得（1.2～1.9）×106個(gè)轉(zhuǎn)化子，重組率達(dá)93.7％，文庫插入片段大小為0.2kb～5kb。 結(jié)論：成功構(gòu)建了SW1116/HCPT細(xì)胞株cDNA文庫。 二、酵母雙雜交誘餌蛋白SAPK1融合質(zhì)粒構(gòu)建及初步鑒定 目的：以應(yīng)激活化蛋白底物1（SAKS1）全基因?yàn)橥庠雌?，?gòu)建

4、酵母雙雜交體系中結(jié)合域載體，研究其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)，并在cDNA文庫中尋找與其相互作用的基因。 方法：以人結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞株（Hydroxycamptothecin-resistant Human Colon Cancer Cell Line SW1116/HCPT）基因組為模板，擴(kuò)增應(yīng)激活化物蛋白（SAKS1）全基因片段克隆入T載體，酶切鑒定及序列測定后克隆入酵母雙雜交體系結(jié)合域載體pGBKT7，構(gòu)建pGBKT7-S

5、AKS1載體。再次酶切鑒定陽性克隆后轉(zhuǎn)入酵母，驗(yàn)證其自身激活作用以及毒性作用。 結(jié)果：測序以及限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果表明，插入片段和重組質(zhì)粒的大小與理論推測值相符。營養(yǎng)缺陷篩選證明重組質(zhì)粒pGBKT7-SAKS1成功轉(zhuǎn)入酵母菌中，重組質(zhì)粒無自主激活報(bào)道基因的能力且對(duì)酵母的生長無毒性。 結(jié)論：pGBKT-SAKS1載體在酵母細(xì)胞中能夠表達(dá)出融合蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證無自身激活及毒性作用，此載體構(gòu)建成功，適用于酵母雙雜交體系。

6、 三、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和葉酸預(yù)防大鼠消化道腫瘤的研究 目的：研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和葉酸對(duì)甲基硝基亞硝基胍（MNNG）誘導(dǎo)大鼠消化道腫瘤的干預(yù)作用及其作用機(jī)制。 方法：159只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為7組：對(duì)照組（C組）、腫瘤模型組（M組）、EGCG對(duì)照組（E組）、葉酸對(duì)照組（F組）、EGCG干預(yù)組（ME組）、葉酸干預(yù)組（MF組）和EGCG+葉酸干預(yù)組（MEF組）。第29周停止MNNG和藥

7、物干預(yù)，第44周終止實(shí)驗(yàn)。組織學(xué)評(píng)價(jià)各組消化道腫瘤的發(fā)生情況，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測腫瘤增殖活性指標(biāo)Ki-67表達(dá)，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：與M組相比，ME組和MEF組Ki-67染色陽性率顯著降低（P=0.038，P=0.009）；ME組、MF組和MEF組平均凋亡率顯著增高（P=0.000，P=0.003，P=0.000）。其余無顯著差異，各干預(yù)組之間比較也無顯著差異（P>0.05）。 結(jié)論：