pGBKT7-hSOD1cDNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建和序列分析.pdf

1、目的：(1)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，從人正常肝細(xì)胞中擴(kuò)增出hSOD1cDNA。（2）采用基因克隆技術(shù)，構(gòu)建pGBKT7-hSOD1cDNA重組質(zhì)粒；(3)通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行雙酶切凝膠電泳和測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)測(cè)序報(bào)告結(jié)果中hSOD1基因序列進(jìn)行序列與結(jié)構(gòu)相關(guān)的生物信息學(xué)分析，為認(rèn)識(shí)該基因結(jié)構(gòu)與功能提供借鑒。
　　方法：(1)目的基因的提?。簭娜苏８渭?xì)胞中提取總RNA,然后對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生第一條cDNA鏈。根據(jù)GeneBank中人Cu/Z

2、n-SODcDNA序列（序列號(hào)：AB087266）設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物,對(duì)反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的第一條cDNA鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得目的基因。(2)穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：①?gòu)?fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室保存的含穿梭質(zhì)粒pGBKT7的DH5ɑ菌種，用質(zhì)粒抽提試劑盒抽取質(zhì)粒pGBKT7；②用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pGBKT7，獲得線性化的pGBKT7片段，在T4DNA連接酶的作用下與目的基因連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-hSOD1cDNA；③對(duì)重組質(zhì)粒pGB

3、KT7-hSOD1cDNA進(jìn)行酶切鑒定；④將重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行DNA序列分析。（3）hSOD1cDNA基因的生物信息分析：根據(jù)測(cè)序報(bào)告結(jié)果中hSOD1基因序列，用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行同源性、分子量等項(xiàng)的分析和預(yù)測(cè)。
　　結(jié)果：（1）利用分子生物學(xué)技術(shù)，成功擴(kuò)增出目的hSOD1cDNA基因。（2）重組質(zhì)粒pGBKT7-hSOD1cDNA經(jīng)過(guò)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切后，進(jìn)一步將重組體進(jìn)行基因測(cè)序分析，驗(yàn)證了克隆的hSOD1cD

4、NA序列與GeneBank中（AB087266）公布的hSOD1序列相符合。這一結(jié)果表明重組體pGBKT7-hSOD1cDNA中插入的目的基因是正向的、單倍插入。（3）hSOD1生物信息分析結(jié)果顯示，hSOD1全長(zhǎng)459bp，編碼153個(gè)氨基酸，經(jīng)過(guò)GeneBank查詢發(fā)現(xiàn)與人SOD1基因序列有99％同源性。
　　結(jié)論：（1）成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGBKT7-hSOD1cDNA，為深入研究hSOD1功能及與它相互作用蛋白的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)