樹(shù)枝狀酞菁硅—聚合物納米粒子對(duì)實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的光動(dòng)力效應(yīng).pdf

1、多種病因引起的脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）是導(dǎo)致患者中心視力喪失的重要原因之一。治療CNV及相關(guān)疾病是目前眼科學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，很多學(xué)者都致力于尋找有效的治療方法。目前主要的治療方法包括：光動(dòng)力學(xué)療法（photodynamic therapy,PDT）,傳統(tǒng)激光療法，經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?手術(shù)療法，放射療法，藥物治療及吲哚青綠介導(dǎo)的光栓療法等。PDT由于選擇性高、對(duì)周?chē)M織損傷小、不

2、損傷視力，較其它方法安全、有效，是目前較成熟的治療CNV的方法。
　　光敏劑是PDT的核心物質(zhì)，新型光敏劑的研究一直是PDT的研究重點(diǎn)之一。PDT的提出、發(fā)展及應(yīng)用都是隨著光敏劑的發(fā)展而逐漸完善的。具有親水性-親脂性結(jié)構(gòu)的酞菁類(lèi)配合物是很有應(yīng)用前景的靶向型光敏劑。負(fù)載硝基芳基芐醚樹(shù)枝配體軸向取代硅(IV)酞菁聚合物納米粒子（SiPc-n）是一種新型的國(guó)產(chǎn)光敏劑，引入的樹(shù)枝狀軸向取代基團(tuán)能有效抑制酞菁聚集，有利于提高光敏活性，應(yīng)用聚

3、乙二醇單甲醚-乳酸-羥基乙酸共聚物（mPEG-PLGA）雙親性納米粒對(duì)硅(IV)酞菁聚合物進(jìn)行包裹，有效改善水溶性。
　　本研究通過(guò)觀(guān)察SiPc-n介導(dǎo)的PDT對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的影響，以及對(duì)BN大鼠CNV的作用，評(píng)價(jià)SiPc-n治療CNV的可行性和有效性，初步闡明作用機(jī)制，為SiPc-n的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 SiPc-n PDT對(duì)正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

4、（HUVEC）和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）的影響
　　目的：觀(guān)察SiPc-n PDT后體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）增殖和凋亡的變化，探討SiPc-n PDT引起細(xì)胞死亡可能的機(jī)制及對(duì)細(xì)胞功能的影響。
　　方法：1.測(cè)定HUVEC和RPE內(nèi)SiPc-n含量變化：HUVEC和RPE分別與含終濃度20ug/ml SiPc-n的培養(yǎng)液共孵育。間隔數(shù)小時(shí)收集一組細(xì)胞，洗滌、計(jì)數(shù)和超聲破裂細(xì)

5、胞，制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物上清，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算SiPc-n的含量，以此推斷SiPc-n分別在HUVEC和RPE中的攝取和代謝變化規(guī)律。
　　2.SiPc-n PDT對(duì)HUVEC和RPE細(xì)胞增殖的影響：細(xì)胞分為PDT組、光敏劑組、激光組和空白組，分別加入5-20μg/ml SiPc-n，應(yīng)用2-20J/cm2半導(dǎo)體激光照射，CCK-8比色法、臺(tái)盼蘭拒染法觀(guān)察SiPc-n PDT對(duì)HUVEC和RPE增殖的影響。
　　3.

6、SiPc-n PDT引起細(xì)胞死亡形式的檢測(cè)：Hoechst33342染色法和透射電鏡觀(guān)察PDT前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，激光共聚焦檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的變化、結(jié)合Annexin V-PI雙染法判斷細(xì)胞死亡的形式。
　　4.SiPc-n PDT對(duì)HUVEC和RPE功能影響的分析：熒光定量PCR檢測(cè)SiPc-n PDT前后HUVEC和RPE細(xì)胞VEGFmRNA和PEDFmRNA表達(dá)的變化。
　　

7、結(jié)果：1.HUVEC及RPE細(xì)胞內(nèi)的SiPc-n濃度變化存在差異：與SiPc-n共孵育時(shí)，HUVEC10h內(nèi)SiPc-n含量達(dá)到峰值，RPE5h達(dá)高峰。SiPc-n比SiPc達(dá)峰時(shí)間提前，攝取量提高。
　　2.SiPc-n可抑制HUVEC和RPE的增殖：SiPc-n-PDT可抑制HUVEC和RPE細(xì)胞增殖，抑制作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，在20μg/mlSiPc-n和10 J/cm2激光能量時(shí)活細(xì)胞數(shù)明顯減少。
　　3.SiPc-

8、n可誘導(dǎo)HUVEC和RPE發(fā)生線(xiàn)粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡：Hoechst33342染色和透射電鏡可見(jiàn)HUVEC和RPE細(xì)胞經(jīng)SiPc-n PDT后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)凋亡的改變，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸增多；激光共聚焦檢測(cè)SiPc-n PDT組的線(xiàn)粒體膜電位較對(duì)照組明顯下降，差別達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；流式細(xì)胞儀檢測(cè)SiPc-n PDT組較對(duì)照組活性氧產(chǎn)生增多，差別達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合Annexin V-PI雙染法顯示SiPc-n PDT組細(xì)胞

9、死亡以凋亡為主，且HUVEC細(xì)胞組凋亡數(shù)多于RPE細(xì)胞組。
　　4.SiPc-n PDT可引起VEGFmRNA和PEDFmRNA表達(dá)量發(fā)生改變，平衡失調(diào)。
　　結(jié)論：SiPc-n在特定波長(zhǎng)激光的激發(fā)下可表現(xiàn)良好的光動(dòng)力活性。SiPc-n PDT時(shí)可明顯抑制HUVEC和RPE細(xì)胞增殖；SiPc-n-PDT主要誘導(dǎo)HUVEC和RPE細(xì)胞發(fā)生凋亡并導(dǎo)致血管生成相關(guān)基因表達(dá)改變。聚合物納米載體可提高藥物的靶向性和攝取率。
　　

10、第二部分 激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型的建立和評(píng)估
　　目的：觀(guān)察倍頻532nm激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型的成模時(shí)間和變化規(guī)律，探討適宜PDT治療的時(shí)間點(diǎn)。
　　方法：25只健康BN大鼠行倍頻532nm激光眼底光凝，等分為5組，4只健康BN大鼠做為正常對(duì)照組，激光功率140 mw，光斑直徑50μm，曝光時(shí)間100ms。分別于7d、14d、21d、28d、56d光凝后行熒光血管照影（FFA）、吲哚菁綠血管照影（ICGA）、眼底光

11、學(xué)相干斷層掃描（OCT）檢查、光鏡觀(guān)察、免疫組織化學(xué)檢查。
　　結(jié)果：光凝后14d開(kāi)始出現(xiàn)CNV，28d達(dá)高峰，成模率84％，F(xiàn)FA示典型圓盤(pán)狀滲漏，ICGA可見(jiàn)CNV充盈，OCT、組織學(xué)檢查均可見(jiàn)CNV形成。
　　結(jié)論：倍頻532nm激光光凝可成功誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型，成模率高，成模時(shí)間短，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。21-28d可做為PDT治療的時(shí)間點(diǎn)。
　　第三部分 SiPc-n介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法治療BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管

12、r>　　目的：觀(guān)察不同劑量SiPc-n PDT對(duì)BN大鼠CNV的影響，探討SiPc-n PDT治療CNV的可行性。
　　方法：光凝后28d，取有典型的CNV的大鼠21只，分為SiPc-n介導(dǎo)的PDT1組(注射3mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射83s)、2組：SiPc-n介導(dǎo)的PDT2組(注射6mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射83s)、3組：SiPc-n介導(dǎo)的 PDT3組(注射3mg/m2SiPc

13、-n+600mW/cm2激光照射166s)、4組：SiPc-n介導(dǎo)的 PDT4組(注射6mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射166s)、5組：維替泊芬介導(dǎo)的PDT組（注射6mg/m2維替泊芬+激光照射83s）、6組：應(yīng)用SiPc-n后不打激光組（注射6mg/m2SiPc-n）、7組：空白對(duì)照組。尾靜脈注射光敏劑后20min后開(kāi)始激光照射，所用參數(shù)：光斑直徑2400μm，激光能量密度：50J/cm2，輸出功率：600 mW/

14、cm2，光照時(shí)間83s或166s。治療后7d行眼底鏡、FFA檢查、OCT、光鏡、免疫組化和電鏡檢查。
　　結(jié)果：FFA顯示各治療參數(shù)的CNV閉合程度不同，隨能量的增加和光敏劑劑量的增加而提高。光凝后1d，PDT組視網(wǎng)膜水腫，各組CNV熒光滲漏無(wú)改變；光凝后7d，維替泊芬組、注射6mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射166s組滲漏停止率高于其它組別，其余組CNV滲漏均無(wú)改變。
　　結(jié)論：選擇適當(dāng)參數(shù)SiPc-n