本氏煙抗疫病轉錄因子的篩選及兩個WRKY類轉錄因子的抗病功能研究.pdf

1、轉錄因子(Transcription Factor)一般與啟動子區(qū)域內的順式作用元件特異性結合，調控目的基因在特定時空的表達。根據其DNA結合域(DNA-binding domain，DBD)可劃分為不同的家族，包括AP2/ERF家族、WRKY家族、MYB家族、NAC家族等。植物中的轉錄因子在調控其生長發(fā)育、應答病原菌侵染等多種生物過程中起重要作用。研究植物中抗病相關轉錄因子，對獲得新的抗病基因和了解植物抗病發(fā)生過程均有重要意義。本研究

2、通過分析本氏煙與寄生疫霉互作轉錄組數據，并利用實時熒光定量PCR技術篩選到18個參與本氏煙的抗疫霉過程的轉錄因子;進一步通過基因同源比對的方法獲得了兩個抗病相關的轉錄因子，并初步研究了其參與本氏煙抗病的機制。
　　本氏煙中抗疫霉轉錄因子的篩選:為了尋找在本氏煙抗疫霉菌過程中發(fā)揮作用的轉錄因子，選擇經過寄生疫霉(Phytophthora parasitica)侵染6h的本氏煙葉片，以未經處理的葉片為對照，建立本氏煙與寄生疫霉互作的轉

3、錄組數據表達譜，利用生物信息學分析本氏煙在疫霉誘導下轉錄因子的差異表達情況。結果表明，有235個轉錄因子基因受疫霉誘導上調表達，參照已報道的擬南芥或普通煙中受病原菌誘導的轉錄因子，從中挑選了71個同源的上調表達4倍以上的基因，通過qRT-PCR的方法驗證挑選基因的表達模式，最終獲得18個表達4倍以上的基因，推測這18個基因可能直接參與本氏煙的抗疫霉過程。
　　本氏煙NbWRKY40轉錄因子的抗病功能研究:根據文獻報道中擬南芥(Ar

4、abidopsis thaliana)和普通煙(Nicotiana tabacum)中具有抗病及抗脅迫功能的Ⅱa亞類WRKY40轉錄因子的序列，通過本氏煙轉錄組數據分析及基因同源克隆法，獲取本氏煙中的NbWRKY40基因。通過實時熒光定量PCR檢測該基因受疫霉誘導表達的情況，結果顯示該基因受疫霉誘導上調表達。為了探究該基因在本氏煙中的抗病相關功能，利用病毒介導的基因沉默技術(Virus-induced gene silencing，VI

5、GS)，分別用半活體營養(yǎng)型寄生疫霉和死體營養(yǎng)型灰霉菌作為測試菌株，檢測基因沉默對本氏煙抗性指標的影響。結果表明，沉默Nb WRKY40基因降低了本氏煙對疫霉菌的抗性，同時細胞學觀察表明，在接種點附近菌絲積累量增加、細胞壞死程度增強，過氧化氫積累和胼胝質沉積都明顯減少。而該轉錄因子沉默也降低了本氏煙對灰霉菌的抗性。進一步檢測NbWRKY40基因沉默對抗病信號通路相關基因PR1b、PR2b，LOX, ERF1的表達量的影響，結果表明，NbW

6、RKY40基因沉默導致參與抗病和SA途徑的PR1b、PR2b基因的疫霉誘導表達能力明顯下降。推測Nb WRKY40基因可能依靠SA介導的信號通路參與調控本氏煙抗病性。
　　本氏煙NbWRKY1轉錄因子抗病相關功能研究:參考文獻報道以及本氏煙轉錄組數據，在本氏煙中獲得一個Ⅰ亞類的NbWRKY1基因，采用VIGS的方法來研究其在本氏煙中的抗病功能。結果顯示，沉默NbWRKY1基因會降低本氏煙對于寄生疫霉和灰霉菌的抗性，對寄生疫霉菌的侵