外源性CO釋放分子(CORM-2)對小鼠同種異基因皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的抑制作用及分子機(jī)制.pdf

1、人體器官同種異基因移植的研究和臨床應(yīng)用經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展，取得了長足的進(jìn)步[1，2]。據(jù)統(tǒng)計，到1997年底，世界各國共實施同種異體肝移植超過6萬例次；親屬供腎最長存活期36年，尸體供腎最長存活期33年，無關(guān)活體供腎最長存活期19年；共實施單側(cè)肺移植超過5300例次，雙肺移植3700余例次，心肺聯(lián)合移植2500余例次；心臟移植超過48000例次，年均手術(shù)量仍以3500例次遞增；實施同種異體造血干細(xì)胞移植17000余例次。這些成就的取得

2、得益于各種免疫抑制劑的研究與發(fā)展。目前發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的藥物主要有以下5類：化學(xué)制劑類、激素類、真菌代謝產(chǎn)物類、中藥及其有效成分、多克隆和單克隆抗淋巴細(xì)胞抗體。這些免疫抑制劑的療效已通過臨床應(yīng)用得到肯定。但是，由于非特異性抗免疫排斥的局限，在長期服用傳統(tǒng)免疫抑制劑的情況下會出現(xiàn)諸多致命的并發(fā)癥，如腫瘤、全身免疫力低下、中樞及肝腎功能損害等等。因此，研究高效、低毒、特異性免疫抑制劑成為當(dāng)今移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 一氧化碳(CO

3、)常溫常壓下是一種雙原子、小分子的氣態(tài)物質(zhì)，由于一氧化碳可與機(jī)體內(nèi)血紅_蛋白結(jié)合生成碳氧血紅蛋白(HbCO)，使得血液運(yùn)輸氧的能力發(fā)生障礙，高濃度時還可與還原性細(xì)胞色素氧化酶的兩價鐵結(jié)合，抑制組織呼吸，故CO在以往被認(rèn)為是有毒氣體，對CO的研究僅局限于它的生物學(xué)毒性。近年來，大量的研究證實一氧化碳(CO)與一氧化氮(NO)相類似，也是一種重要的氣體細(xì)胞信使分子，在細(xì)胞功能和通訊的調(diào)節(jié)力一面發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用[5]。到1990年代初，

4、Snyder等[6]提出至少在一種類型的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，CO將不僅僅是副產(chǎn)物且作為cGMP的調(diào)節(jié)分子，它將和NO一樣激活生物信號。Snyder等研究證明，cGMP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嗅覺信號傳導(dǎo)中起了重要的作用，而這種作用可被HO的抑制劑阻斷，從而提出了CO的分子信號作用。 在本研究中，我們利用可以在機(jī)體內(nèi)釋放CO的一種新型金屬—羰基化合物一氧化碳釋放分子(CORM-2)，通過建立同種異基因小鼠皮膚移植模型并用CO處理，研究外源性CO是

5、否對同種異基因皮膚移植后的急性排斥反應(yīng)有抑制作用，并探討可能的分子機(jī)制。 第一部分小鼠同種異基因皮膚移植模型的建立與外源性一氧化碳釋放分子CORM-2藥理學(xué)指標(biāo)的確定 目的：1、建立同種異基因小鼠皮片移植模型并驗證其可靠性；2、確定外源性一氧化碳的安全實驗濃度。 方法：取清潔級6周齡(約25g左右)雄性ICR和BABL/C小鼠分別作為供體和受體建立同種異基因皮膚背—背移植模型，分5組，每組10只，以氯胺酮按100

6、mg/Kg腹腔注射麻醉，于術(shù)后立即連續(xù)7天每天一次尾靜脈注射CORM-2：1組空白組；2組1mg/Kg；3組4mg/Kg；4組8mg/Kg；5組12mg/Kg。于給藥結(jié)束后無菌條件下分離出各組存活小鼠脾臟淋巴細(xì)胞作體外細(xì)胞培養(yǎng)48h后觀察細(xì)胞形態(tài)及活性。 結(jié)果：1、移植48小時，皮片成活率超過90％；2、移植后7天內(nèi)，除去麻醉意外死亡的小鼠，1組、2組、3組、4組未出現(xiàn)明顯中毒現(xiàn)象，5組死亡6只。3、通過淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)的活力測

7、定，8mg/kg的濃度為最佳實驗濃度。 結(jié)論：1、采用氯胺酮按100mg/Kg腹腔注射麻醉，背—背移植術(shù)式，創(chuàng)可貼—凡士林油紗布加壓包扎的小鼠皮片移植方法是簡便可行的同種異基因小鼠皮膚移植模型造模方法。2、本實驗中小鼠尾靜脈注射CORM-2的安全劑量可定為8mg/Kg。 第二部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對同種異基因小鼠皮膚移植后移植物的實驗觀察 目的：分別從大體、細(xì)胞、蛋白水平研究外源性一氧化碳釋放分

8、子CORM-2對小鼠同種異基因皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的影響。 方法：以清潔級ICR小鼠、BALB/C小鼠分別作為供體和受體建立異體皮膚移植模型，共分5組：1組假手術(shù)組，2組同種異基因皮膚移植組，3組同種異基因皮膚移植+CORM-2組，4組異體皮膚移+iCORM-2組，5組異體皮膚移植+CsA組；術(shù)后分別依據(jù)每組要求給藥，觀察移植皮片排斥程度，觀察期為7天。于觀察期結(jié)束時，分別取下移植皮片以4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)病

9、理、免疫組化檢測。 結(jié)果：通過對移植皮片平均存活時間、皮片病理、皮片免疫組化等幾項檢測指標(biāo)的對比，經(jīng)CORM-2處理組的受體小鼠與經(jīng)CsA處理組的小鼠的各項排斥指標(biāo)均有不同程度降低。 結(jié)論：外源性一氧化碳對同種異基因皮膚移植后皮片的存活有一定的延長作用，對同種異基因皮膚移植急性排斥反應(yīng)有一定的抑制作用。 第三部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細(xì)胞的影響 目的：運(yùn)用流

10、式細(xì)胞技術(shù)、ELISA和淋巴細(xì)胞體外增殖試驗三種方法觀察經(jīng)過外源性一氧化碳CORM-2處理7天的小鼠同種異基因皮膚移植模型受體小鼠脾淋巴細(xì)胞的功能變化。 方法：以清潔級ICR小鼠、BALB/C小鼠分別作為供體和受體建立異體皮膚移植模型，共分5組：1組假手術(shù)組，2組同種異基因皮膚移植組，3組同種異基因皮膚移植+CORM-2組，4組異體皮膚移+iCORM-2組，5組異體皮膚移植+CsA組，術(shù)后分別依據(jù)每組要求經(jīng)尾靜脈給藥，共給藥7天

11、，每天1次。于觀察期結(jié)束時，在無菌條件下，分別取每只受體小鼠的外周全血、血清。 結(jié)果：1、運(yùn)用流式細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CORM-2干預(yù)的小鼠脾臟CD4+T/CD8+T的比值明顯低于對照組；2、小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外分別經(jīng)有絲分裂原、經(jīng)過絲裂霉素預(yù)處理的異基因小鼠淋巴細(xì)胞刺激48小時后，運(yùn)用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CORM-2預(yù)處理的小鼠淋巴細(xì)胞體外增值能力明顯低于對照組。3、通過采集小鼠外周血清，運(yùn)用