落新婦甙對大鼠肺移植排斥反應(yīng)抑制作用的實驗研究.pdf

1、第一部分、大鼠同種異體原位肺移植模型的建立。 目的：通過大鼠套管法吻合技術(shù)建立大鼠左側(cè)原位肺移植模型。 方法：將60只SPF級SD大鼠隨機分為供、受體兩組，采用三套管吻合技術(shù)完成大鼠肺移植模型。 結(jié)果：30例手術(shù)中，供肺灌注到摘取時間（10±1）分鐘，供肺完成套管時間（10±4）分鐘，供體動靜脈、支氣管吻合時間（15±2）分鐘，移植肺熱缺血時間（16±2）分鐘，冷缺血時間（30±5）分鐘，手術(shù)平均時間（80±10

2、）分鐘，術(shù)后15天生存率達86％，其中兩例死于急性肺水腫，一例死于肺靜脈栓塞，一例死于對側(cè)氣胸。 結(jié)論：三套管大鼠同種異體肺移植模有效、可靠，為臨床肺移植提供了較好的實驗基礎(chǔ)，但是模型操作復(fù)雜，需要長時間的學(xué)習(xí)和反復(fù)操作來提高肺移植模型的穩(wěn)定性。 第二部分、落新婦甙對大鼠肺移植排斥反應(yīng)的抑制作用。 目的：運用排斥反應(yīng)分級及觀察落新婦甙對大鼠移植肺中支氣管肺泡灌洗液誘導(dǎo)肺成纖維細胞膠原增生的抑制作用實驗，探討落新婦

3、甙對大鼠肺移植排斥反應(yīng)的抑制作用。 方法：采用大鼠左側(cè)原位肺移植模型。隨機將肺移植后的60只大鼠分為4組：A組肺移植后用生理鹽水(1ml/天)灌胃，B組肺移植后用環(huán)孢素A(5mg/kg/天)灌胃，C組肺移植后用落新婦甙（1mg/kg/天)灌胃，D組肺移植后用環(huán)孢素A （2.5mg/kg/天)及落新婦甙（1mg/kg/天)灌胃。術(shù)后第30天（每組抽取5 只大鼠）切取移植肺觀察肺急性排斥反應(yīng)分級情況；另外每組10只大鼠，取受體支氣管

4、肺泡灌洗液。用收集的支氣管肺泡灌洗液在體外刺激人胚胎成纖維細胞，通過MTT比色法和酶聯(lián)免疫（ELISA）法分別檢測人胚肺成纖維細胞的增殖及Ⅰ型膠原的合成，并對檢測結(jié)果進行分析。 結(jié)果： （1）B組、C組及D組移植肺排斥反應(yīng)分級均低于A組（P<0.01）；D組移植肺急性排斥反應(yīng)最輕，優(yōu)于C組（P<0.05）和B組（P<0.01）。 （2）受者移植肺中支氣管肺泡灌洗液顯著促進了人胚肺成纖維細胞的增殖和膠原合成。

5、 （3）B、C、D組的支氣管肺泡灌洗液誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細胞Ⅰ型膠原合成有顯著的抑制作用（P<0.05）。 結(jié)論：落新婦甙可抑制大鼠移植肺中支氣管肺泡灌洗液誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細胞的增殖及膠原合成，對大鼠肺移植后的閉塞性細支氣管炎具有抑制作用；對肺移植排斥反應(yīng)有較強的抑制作用，并與環(huán)孢素A具有協(xié)同作用。 第三部分、落新婦甙對大鼠肺移植急性排斥反應(yīng)抑制作用的機制研究。 實驗一：落新婦甙對肺移植大鼠活化T細胞的動態(tài)影

6、響。 目的：觀察落新婦甙對大鼠移植肺活化T細胞的影響及動態(tài)變化，探討落新婦甙對大鼠移植肺活化T細胞的作用。 方法：采用大鼠左側(cè)單肺原位移植模型。大鼠10只不做移植，抽取外周血作為空白對照；隨機將肺移植后的40只大鼠分為2組：A組肺移植后用生理鹽水(1ml/天)灌胃，B組肺移植后落新婦甙（1mg/kg/天)灌胃。移植前（空白對照）、術(shù)后第2天、術(shù)后第5天，分別用熒光標(biāo)記抗體雙染色結(jié)合流式細胞技術(shù)檢測各階段大鼠T細胞表達的活

7、化抗原CD69、CD25和CD71的表達。 結(jié)果：術(shù)后第2天，各組檢測的CD69、CD25和CD71抗原均顯著高于對照組（P<0.01），且B組和A組有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），顯示術(shù)后第2天，活化T細胞增加，但落新婦甙能顯著抑制T細胞的活化。術(shù)后第5天，B組CD69、CD25和CD71抗原基本降至正常水平，顯著低于A組。 結(jié)論：落新婦甙能顯著抑制急性排斥反應(yīng)誘導(dǎo)的T細胞活化，對肺移植排斥反應(yīng)有較強的抑制作用。

8、 實驗二：落新婦甙誘導(dǎo)移植肺活化T細胞凋亡減輕急性排斥反應(yīng)。 目的：探討落新婦甙對大鼠肺移植后機體急性排斥反應(yīng)的影響和機制。 方法：建立大鼠左肺原位移植模型，術(shù)后將受體大鼠隨機分為兩組：對照組和實驗組。對照組術(shù)后生理鹽水1ml/天灌胃，實驗組術(shù)后落新婦甙1mg/kg/天灌胃，觀察肺移植的存活時間、大鼠脾細胞T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和脾淋巴細胞IL-2活性，以及外周血中活化T細胞凋亡。 結(jié)果：與對照組相比，實驗組脾細胞T淋

9、巴細胞轉(zhuǎn)化率明顯降低，兩組差異有顯著意義（P<0.05）。移植大鼠脾淋巴細胞IL-2活性在實驗組中為4.25±2.65UI/ml，對照組IL-2活性為23.46±1.82UI/ml，兩組有顯著差異（P<0.01）。實驗組能有效的誘導(dǎo)急性排斥反應(yīng)中活化T細胞凋亡。 結(jié)論：落新婦甙通過下調(diào)IL-2產(chǎn)生和抑制體內(nèi)IFN-γmRNA，誘導(dǎo)活化T細胞凋亡，抑制T淋巴細胞增殖分化，廣泛抑制了以T細胞為主的肺移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，從而延長大鼠

10、肺移植的存活時間。 實驗三：活化T細胞信號凋亡傳導(dǎo)通路在落新婦甙抑制肺移植排斥反應(yīng)中作用。 目的：用大鼠左肺原位移植模型，探討落新婦甙對大鼠肺移植排斥反應(yīng)中活化T細胞p38 絲裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）和PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路的影響。 方法：建立大鼠左肺原位移植模型，在第30天提取大鼠外周血分離活化T細胞進行體外培養(yǎng)，并進行實驗分組，A～D組。A組（對照組），行細胞培養(yǎng)；B組（落新婦甙組），培養(yǎng)液中

11、加入落新婦甙15mg/L；C組，落新婦甙（15mg/L）加p38MAPK 抑制劑SB203580（5μmol/L）；D組，術(shù)后每天落新婦甙（15mg/L）加PI3K/Akt 抑制劑LY294002（10μmol/L）。TUNEL法檢測T淋巴細胞凋亡情況。RT-PCR和Western blot法檢測T細胞p38MAPK和PI3K及Akt 游表達的情況。 結(jié)果：B組（落新婦甙組）T細胞凋亡指數(shù)和p38MAPK表達明顯高于對照組，而P

12、I3K/Akt明顯低于對照組。C組（落新婦甙加p38MAPK 抑制劑組）T細胞凋亡和p38MAPK表達均明顯低于B組（落新婦甙組）（P<0.01），PI3K/Akt明顯高于對照組，但均與對照組無顯著差異（P>0.05）。D組（落新婦甙加PI3K/Akt 抑制劑LY294002組）T細胞凋亡和PIK3/Akt表達明顯高于對照組，p38MAPK明顯低于對照組。 結(jié)論：落新婦甙誘導(dǎo)大鼠肺移植排斥反應(yīng)中活化T細胞凋亡與其激活p38MAP