半胱氨酰白三烯受體介導(dǎo)小鼠興奮性毒性腦損傷及腦冷凍傷.pdf

1、腦缺血、腦外傷等腦損傷性疾病,是發(fā)病率、致殘率和致死率均高的中樞神經(jīng)病變,故對(duì)腦缺血、腦外傷等損傷/抗損傷機(jī)制的研究,探索其防治措施,有重要的意義.在過(guò)去的15～20年,越來(lái)越多的證據(jù)表明,神經(jīng)興奮性毒性對(duì)神經(jīng)元缺失所起的作用是最主要的發(fā)病機(jī)制之一,其中,N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體在介導(dǎo)急性谷氨酸興奮性毒性中起到關(guān)鍵性作用,NMDA受體拮抗劑的應(yīng)用能降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血性腦損傷中的神經(jīng)元

2、死亡. 白三烯類(1eukotrienes,LTs)是花生四烯酸經(jīng)5一脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOx)代謝產(chǎn)生的一族脂類炎性介質(zhì).LTs包括白三烯B4(LTB4)以及半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes,CysL,Ts,包括LTC4、LTD4、LTE4).CysLTs通過(guò)激活半胱氨酰白三烯受體(包括CysLT<,1>和CysLT<,2>受體),參與多種炎癥病理過(guò)程,介導(dǎo)平滑肌痙攣、微血管

3、滲漏等反應(yīng). 這兩種受體(CysLT<,1>和CysLT<,2>受體)己相繼被克隆.它們均為經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體,與Gq蛋白偶聯(lián).很多CysLTs受體拮抗劑也相繼被開(kāi)發(fā),如孟魯司特(montelukast)、普魯司特(pranlukast)等.早期,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體研究主要集中在外周組織,如呼吸系統(tǒng)等外周疾病.近幾年來(lái)的研究表明,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體也在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá),可

4、能參與腦缺血、腦外傷和腦退行性疾病等中樞疾病.腦缺血后,腦內(nèi)5-LOX表達(dá)增加、活性增高,其代謝產(chǎn)物CysLTs顯著增加;CysLT<,1>和CysLT<,2>受體也被誘導(dǎo)表達(dá). 我們實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn),CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特可保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦缺血性損傷.而且,在腦外傷和腦腫瘤病人的神經(jīng)元樣和膠質(zhì)樣細(xì)胞,CystLT<,1>和CysLT<,2>這兩種受體均可誘導(dǎo)表達(dá).目前,已有研究證明腦缺血時(shí),CysLTs濃度

5、一時(shí)性增高,并且該作用與NMDA受體激活有關(guān).然而,還沒(méi)有直接證據(jù)顯示CysLT<,1>和CysLT<,2>受體在興奮性毒性中的作用. 尚未闡明,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體在神經(jīng)元中是否有表達(dá)?是否直接參與了神經(jīng)元的興奮性毒性損傷? 本研究擬建立小鼠皮層直接注射NMDA誘導(dǎo)腦興奮性毒性損傷模型,并闡述上述問(wèn)題.同時(shí),在另一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦損傷模型一小鼠腦冷凍傷模型上,觀察CysLT<,1>受體的表達(dá)特征,以及CysL

6、T<,1>受體拮抗劑普魯司特對(duì)腦冷凍傷的治療時(shí)間窗. 第一部分 小鼠NMDA誘導(dǎo)腦損傷后腦內(nèi)半胱氨酰白三烯受體1表達(dá)增加 介導(dǎo)神經(jīng)元損傷興奮性毒性在腦損傷中起關(guān)鍵性作用;半胱氨酰白三烯(CysLTs)及其受體(CysLT<,1>受體)也參與腦損傷病理過(guò)程.但兩者間的關(guān)系尚無(wú)直接證據(jù)證明.為研究CysLT<,1>受體在興奮性毒性腦損傷中的作用,首先建立了皮層直接注射NMDA (50～150 nmol,0.5μ1)誘導(dǎo)興奮性

7、毒性腦損傷模型.觀察NMDA注射24 h后,CysLT<,1>受體在腦內(nèi)的表達(dá)情況;同時(shí)觀察了CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特(0.01和0.1 mg/kg)、NMDA受體拮抗劑氯胺酮(30 mg/kg)及自由基清除劑依達(dá)拉奉(9 mg/kg)的作用.我們發(fā)現(xiàn),NMDA誘導(dǎo)腦損傷后,CysLT<,1>受體的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào);并且,免疫雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,CysLT<,1>受體誘導(dǎo)表達(dá)于損傷區(qū)的神經(jīng)元.普魯司特、氯胺酮和依達(dá)拉奉對(duì)

8、NMDA誘導(dǎo)腦損傷具有保護(hù)作用.普魯司特(0.1 mg/kg)、氯胺酮能抑制CysLT<,1>受體表達(dá)上調(diào).這些結(jié)果表明,CysLT<,1>受體可能介導(dǎo)NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性損傷. 第二部分 小鼠NMDA誘導(dǎo)腦損傷后腦內(nèi)半胱氨酰白三烯受體2的表達(dá)特征 CysLT<,2>受體是最近得到克隆和鑒定的CysLT受體之一,它相對(duì)較高地表達(dá)于人腦組織,在多個(gè)腦區(qū)都有分布.在腦外傷病人腦樣本中,CysLT<,2>受體誘導(dǎo)表達(dá)

9、于神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)樣細(xì)胞.為進(jìn)一步研究CvsLT<,2>受體在興奮性毒性腦損傷中的變化,我們用RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法,研究了小鼠NMDA誘導(dǎo)腦損傷后,CysLT<,2>受體在腦內(nèi)的表達(dá)特征.RT-PCR結(jié)果顯示,在損傷區(qū)CysLT<,2>受體mRNA在NMDA注射后24 h表達(dá)上調(diào);而非損傷的對(duì)側(cè)腦區(qū)CysLT<,2>受體mRNA水平?jīng)]有變化.免疫雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,NMDA損傷后24h,CysLT<,2>受體主要表達(dá)于損傷區(qū)的

10、神經(jīng)元,而不表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞.這些結(jié)果表明,CvsLT<,2>受體在興奮性毒性腦損傷后可能介導(dǎo)急性期神經(jīng)元損傷. 第三部分小鼠腦冷凍傷后半胱氨酰白三烯受體1的表達(dá)及拮抗劑普魯司特時(shí)間依賴性保護(hù)作用 最近,我們報(bào)道在腦外傷病人樣本中,CysLT<,1>受體誘導(dǎo)表達(dá)于神經(jīng)元樣和膠質(zhì)樣細(xì)胞.為進(jìn)一步研究CysLT<,1>受體在腦外傷中的作用,我們研究了小鼠腦冷凍傷后3 h～48 h,CysLT<,1>受體在腦內(nèi)表達(dá)的時(shí)間特征

11、;同時(shí)觀察損傷后給予CvsLT<,1>受體拮抗劑普魯司特,對(duì)小鼠腦冷凍傷的治療作用.RT-PCR結(jié)果顯示,在損傷后6 h,12 h和24 h,損傷側(cè)皮層CvsLT<,1>受體mRNA表達(dá)上調(diào),而非損傷的對(duì)側(cè)皮層CysLT<,1>受體mRNA水平在48 h內(nèi)沒(méi)有變化.免疫雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,腦冷凍傷后24 h,CysLT1受體主要表達(dá)于損傷周邊區(qū)神經(jīng)元,而不表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞.CysLT1受體拮抗劑普魯司特,對(duì)小鼠腦冷凍傷具有時(shí)間依賴的神經(jīng)

12、保護(hù)作用,其治療時(shí)間窗為損傷后30 min.這些結(jié)果提示,CysLT1受體介導(dǎo)腦冷凍傷后急性期神經(jīng)元損傷;普魯司特對(duì)腦外傷可能具有治療作用. 結(jié)論 1. 小鼠皮層注射.NMDA誘導(dǎo)興奮性毒性腦損傷后CysLT<,1>和CysLT<,2>受體表達(dá)上調(diào).腦損傷后24 h,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體主要表達(dá)于損傷區(qū)的神經(jīng)元,而不表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞.表明CysLT<,1>和CysLT<,2>受體可能與NMDA誘導(dǎo)

13、的神經(jīng)元興奮性毒性損傷有關(guān). 2.CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特,能減輕NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,并抑制損傷后的CysLT<,1>受體表達(dá)上調(diào),證實(shí)CysLT<,1>受體介導(dǎo)NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性損傷. 3.小鼠腦冷凍傷后CysLT<,1>受體表達(dá)上調(diào),表達(dá)高峰是6～24 h;主要表達(dá)于損傷周邊區(qū)的神經(jīng)元.CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特對(duì)小鼠腦冷凍傷具有時(shí)間依賴的神經(jīng)保護(hù)作用,其治療時(shí)間窗為損傷后30